專(zhuān)利名稱：新型血吸蟲(chóng)疫苗肽(二)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機(jī)化合物。
目前對(duì)血吸蟲(chóng)疫苗的研究主要集中在照射減毒活疫苗和可溶性抗原疫苗兩方面。照射減毒活疫苗的研究歷史較長(zhǎng)，在制備和應(yīng)用方面已積累了較成熟的經(jīng)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上已取得了較好結(jié)果。但該種疫苗還存在以下有待解決的問(wèn)題，(1)大量注射引起的局部炎癥，(2)疫苗的安全性，如過(guò)敏反應(yīng)，(3)疫苗的致病性，如滅活不完全造成的感染，(4)大規(guī)模制備疫苗時(shí)蟲(chóng)子的來(lái)源不足。為了避免上述缺點(diǎn)，人們正在積極從事合成的可溶性抗原疫苗的研究，此種疫苗的重要意義在于，可以采用人工大量合成，經(jīng)人工合成的疫苗接種量小，可以減少異種蛋白的過(guò)敏反應(yīng)，并可大量制備，且無(wú)滅活不完全造成的致病危險(xiǎn)，有實(shí)際應(yīng)用前景。已有技術(shù)，如中國(guó)專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)?4105038.6，給出了一種可用于制備血吸蟲(chóng)疫苗的肽。
本發(fā)明的目的在于提供了另一種可用于制備血吸蟲(chóng)多價(jià)疫苗的多肽，其優(yōu)點(diǎn)在于用其制成的多價(jià)疫苗接種量小，且對(duì)多種血吸蟲(chóng)有免疫作用，可以減少異種蛋白的過(guò)敏反應(yīng)，無(wú)滅活不完全造成的致病危險(xiǎn)，并可以采用人工大量合成。
本發(fā)明所涉及的有機(jī)化合物-多肽，即是血吸蟲(chóng)可溶性抗原疫苗多肽，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示 在上式中A為氫，C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基或RCO-形式的基團(tuán)。在這里(ⅰ)R是氫，C1-11烷基，C2-11烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。
(ⅱ)RCO還可以是(a)天然的氨基酸殘基，也可以是相應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基。
(b)一個(gè)二，三，四肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的也可以是不同的，其所用氨基酸殘基如(a)中定義。
(ⅲ)RCO還可以是(a)天然的四，五，六碳糖酸殘基。
(b)一個(gè)二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然單糖殘基，但與肽連接的單糖殘基為糖酸殘基。
A′為氫，或當(dāng)A為C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基時(shí)，也為C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。
B為-Lys-，-Arg-，-Thr-，-Ser-，-Glu-，-Asp-.
C為-Arg-，-His-，-Glu-，-Asp-.
D為-Leu-，-Ala-，-Arg-.
E為-Asn-，-Glu-，-Asp-，-Gln-，-Thr-，-Ser-.
F為-Asp-，-Asn-，-Glu，-Gln-.
G為-Asp-，-Glu-，-Asn，-Gln-.
H為-Gly-，-Ile-，-Pro-，-Trp-.
X可以為下列形式 在這里R1是氫，C1-3的烴基，天然的四，五，六碳單糖或二，三，四寡糖，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然的四，五，六碳單糖殘基。
R2是氫，或是生理可接受的，并在生理?xiàng)l件下可水解的酯基。
R3和R4是氫，C1-3烴基，苯基，芐基，C9-10苯烴基?；騌3是氫，R4為天然的氨基酸殘基，也可以是相應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基。R4也可以是一個(gè)二至七肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，其所用氨基酸殘基為天然的氨基酸殘基或相應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基。R4還可以是天然的四，五，六碳糖殘基，也還可以是一個(gè)二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然的四，五，六碳單糖殘基。
本發(fā)明涉及的多肽可以以其自由形式存在，也可以以鹽的形式或復(fù)合物的形式存在。例如可以和有機(jī)酸，高聚物酸和無(wú)機(jī)酸形成鹽，這種形式的鹽如鹽酸鹽，乙酸鹽。再如，可以和無(wú)機(jī)物，如無(wú)機(jī)鹽或氫氧化物，形成象Ca2+或Zn2+鹽。也可以和高聚有機(jī)物形成復(fù)合物，以及和藥物可以接受的稀釋劑和載體(如藥物可以接受的蛋白載體)形成的復(fù)合物。
本發(fā)明涉及的多肽可以用已知的多肽化學(xué)方法來(lái)合成及生產(chǎn)，如下述實(shí)施例，并且也可用與本實(shí)施例明顯等價(jià)的化學(xué)合成方法，溶液法或固相合成法(包括叔丁氧羰基保護(hù)法和芴甲氧羰基保護(hù)法)來(lái)合成及生產(chǎn)。
本發(fā)明涉及的多肽及其藥物可以接受的鹽和復(fù)合物在生物活性檢測(cè)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表明均有有價(jià)值的藥物活性。特別是在抗血吸蟲(chóng)病方面，通過(guò)免疫小鼠實(shí)驗(yàn)表明有很高的減蟲(chóng)率。本發(fā)明涉及的多肽在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的用量范圍為0.001到1000μg/kg體重。
實(shí)施例11.Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的制備1.1.Boc-Asp(OBzl)-OCs的制備2.016g(6.24mmole)Boc-Asp(OBzl)-OH溶于40mL乙醇和8mL水中，攪拌溶解，加入1.017g(3.12mmole)Cs2CO3，攪拌至反應(yīng)完，減壓抽干，加入4×20mL干燥苯，減壓抽干以除去水。放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥過(guò)夜，得白色銫鹽。
1.2.Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的制備將上述制得的銫鹽溶于10mL精制過(guò)的DMF中，加入3.0g(含氯量為3.12mmole)氯甲基樹(shù)脂，在保持干燥狀態(tài)下，于80℃適度攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾抽干，依次用3×10mL DMF，3×10mL DMF/H2O(9∶1)，3×10mL DMF，3×10mL無(wú)水EtOH洗滌，抽干，放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥過(guò)夜，得白色Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin。
1.3.Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的封氯向上述Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin中加入2.558g(31.2mmole)無(wú)水乙酸鈉，30mL精制過(guò)的DMF，在70℃適度攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾抽干，依次用2×10mL DMF，2×10mL DMF/H2O(9∶1)，2×10mL DMF，2×10mL無(wú)水EtOH洗滌，抽干，放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥過(guò)夜，得白色封好氯的Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin。
1.4.Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的封羥基向上述封好氯的Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin中加入10mL(0.105mole)重蒸過(guò)的乙酸酐，20mL(0.25mole)處理過(guò)的無(wú)水無(wú)氨吡啶，20mL干燥苯，室溫適度攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾抽干，依次用4×50mL DCM，3×10mL無(wú)水MeOH洗滌，抽干，放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥過(guò)夜，得白色封好氯和羥基的Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin。
經(jīng)茚三酮檢測(cè)氨基含量為0.94mmole/g樹(shù)脂。
2.Boc-Gly-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的制備1.5g(氨基含量為1.41mmole)封好氯和羥基的Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin加入15mL DCM溶漲5分鐘，抽干。
2.1.脫保護(hù)向上述樹(shù)脂中加入15mL TFA/DCM(3∶7)，搖攪30分鐘，抽干，依次用10mLDCM，10mL MeOH各洗三次，抽干。
2.2.中和加入10mL TEA/DCM(1∶9)，搖攪5分鐘，抽干，再加入10mLTEA/DCM(1∶9)，搖攪10分鐘，抽干，用10mLDCM洗三次，抽干。
2.3.偶聯(lián)加入0.525g(3mmlole)Boc-Gly，0.608g(4.5mmole)HOBt，0.727g(4.5mmole)DCC，15mL，DMF，搖攪反應(yīng)6小時(shí)，抽干，10mL DMF洗三次，10mL MeOH洗三次，10mLDCM洗三次，抽干。
2.4.檢測(cè)取少許樹(shù)脂加入試管中，加入茚三酮試劑1，2和3各3滴，105℃加熱5分鐘。若為淡黃色，說(shuō)明偶聯(lián)反應(yīng)完全，可以進(jìn)行下一步反應(yīng);若為藍(lán)色或棕紅色，說(shuō)明偶聯(lián)反應(yīng)不完全，按2.2中和后，重新進(jìn)行2.3偶聯(lián)反應(yīng)，但可根據(jù)反應(yīng)具體情況減少投料。
按上述方法依次接下列氨基酸Boc-Asp(OBzl)，Boc-Asn，Boc-Arg(Tos)，Boc-Asp(OBzl)，Boc-Tyr(OBzl)，Boc-Leu，Boc-Arg(Tos)，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Tyr(OBzl)，Boc-Arg(Tos)，Boc-Glu(OBzl)。
當(dāng)前一個(gè)氨基酸為Pro，Gln和Asn時(shí)，由于在茚三酮試劑檢測(cè)時(shí)其本身為黃色，所以可不檢測(cè)，但為了保證偶聯(lián)反應(yīng)完全，應(yīng)重新偶聯(lián)1-2次。當(dāng)所用氨基酸有Tos為側(cè)連保護(hù)基時(shí)，把HOBt改為HOSu，以免HOBt的堿性把Tos保護(hù)基脫掉。在接上Trp后，脫出Boc保護(hù)時(shí)應(yīng)在TFA/DCM中加入幾滴苯甲硫醚和乙二硫醇。
最后得到聯(lián)在樹(shù)脂上的側(cè)連保護(hù)肽Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Tyr(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Leu-Tyr(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg(Tos)-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Asp(OBzl)-Resin。
附茚三酮檢測(cè)試劑(1).茚三酮試劑1，1mL 0.001N KCN+40mL吡啶;
(2).茚三酮試劑2，40gB苯酚+10mL無(wú)水乙醇;
(3).茚三酮試劑3，2g水合茚三酮+40mL無(wú)水乙醇。
3.H-Glu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Arg-Leu-Tyr-Asp-Arg-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Asp-OH在聚四氟乙烯肽脫保護(hù)裝置中進(jìn)行脫保護(hù)，向反應(yīng)器中加入Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Tyr(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Leu-Tyr(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg(Tos)-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Asp(OBzl)-Resin，0.5mL苯甲醚，0.5mL苯甲硫醚和0.5mL乙二硫醇，在冰水浴冷卻下放入10-15mL經(jīng)無(wú)水三氟化鈷干燥過(guò)的氟化氫，攪拌反應(yīng)45分鐘，減壓抽干，用冷無(wú)水乙醚洗滌，得樹(shù)脂及黏稠物，10%乙酸溶液溶解，過(guò)濾去掉殘?jiān)?，冷凍干燥得干粉，?%乙酸為洗脫劑在SephadexG-15柱上純化，純化兩次，冷凍干燥得固體1.80g，收率72%，[α]18D＝-46.5°(C＝0.2，20%乙酸溶液)。產(chǎn)品肽純度由HPLC和氨基酸組成分析確定。
下列多肽也可以用實(shí)施例1中給出的相似方法來(lái)合成和生產(chǎn)，H-A-Glu-B-Tyr-Glu-Glu-C-D-Tyr-E-Arg-F-G-H-Asp-X-OH實(shí)施例編號(hào)縮寫(xiě)詞語(yǔ)表Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸Boc叔丁氧羰基
Bzl芐基Cbz芐氧羰基DCCN，N′-二環(huán)己基碳二亞胺DCM二氯甲烷DMFN，N-二甲基甲酰胺EtOH乙醇Gln谷氨酰胺Glu谷氨酸Gly甘氨酸His組氨酸HOAc醋酸HOBt1-羥基苯并三氮唑HOSuN-羥基琥珀酰亞胺HPLC高壓液相色譜Ile異亮氨酸Leu亮氨酸Lys賴氨酸MeOH甲醇Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Tos對(duì)甲苯磺?；鵗rp色氨酸Tyr酪氨酸
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種有機(jī)化合物--多肽，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式所示 在上式中A為氫，C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基或RCO-形式的基團(tuán)。在這里(i)R是氫，C1-11烷基，C2-11烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。(ii)RCO還可以是(a)天然的氨基酸殘基，也可以是相應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基。(b)一個(gè)二，三肽殘基，其兩個(gè)氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，其所用氨基酸殘基如(a)中定義。(iii)RCO還可以是(a)天然的四，五，六碳糖酸殘基。(b)一個(gè)二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然單糖殘基，但與肽連接的單糖殘基為糖酸殘基。A′為氫，或當(dāng)A為C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基時(shí)，也為C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。B為-Lys-，-Arg-，-Thr-，-Ser-，C為-Arg-，-His-，D為-Leu-，-Ala-，-Ile-，E為-Asn-，-Glu-，-Asp-，-Gln-，F(xiàn)為-Asp-，-Asn-，-Glu-，-Gln-，G為-Asp-，-Glu-，-Asn-，-Gln-，H為-Gly-，-Ile-，-Pro-，X可以為下列形式 在這里R1是氫，C1-3的烴基，天然的四，五，六碳單糖或二，三，四寡糖，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然的四，五，六碳單糖殘基。R2是氫，或是生理可接受的，并在生理?xiàng)l件下可水解的酯基。R3和R4是氫，C1-3烴基，苯基，芐基，C9-10苯烴基?；騌3是氫，R4為天然的氨基酸殘基，也可以是相應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基。R4也可以是一個(gè)二至七肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，其所用氨基酸殘基為天然的氨基酸殘基或相應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基。R4還可以是天然的四，五，六碳糖殘基，也還可以是一個(gè)二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然的四，五，六碳單糖殘基。
2.如權(quán)力要求1中所述的化合物，其特征在于R3是氫，C1-3烷基和苯基。
3.如權(quán)力要求1中所述的化合物，其特征在于A是一個(gè)RCO形式的基團(tuán)。(ⅰ)R是C1-11烷基，苯基或C7-10苯烷基或。(ⅱ)RCO是(a)天然的氨基酸殘基。(b)一個(gè)二，三，四肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，但均為天然氨基酸殘基。A′為氫。X是下列形式的基團(tuán) R3和R4是氫，C1-3烴基，苯基，芐基，C9-10苯烴基。或R3是氫，R4為天然的氨基酸殘基，也可以是相應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基。R4也可以是一個(gè)二至七肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，其所用氨基酸殘基為天然的氨基酸殘基或相應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基。R4還可以是天然的四，五，六碳糖殘基，也還可以是一個(gè)二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然四，五，六碳單糖殘基。
4.如權(quán)力要求1中所述的化合物，其特征在于，B為-Arg-.C為-Arg-.D為-Leu-.E為-Asp-.F為-Asn-.G為-Asp-.H為-Gly-.
5.如權(quán)力要求1中所述的化合物，其特征在于，B為-Lys-.C為-His-.D為-Leu-.E為-Glu-.F為-Asp-.G為-Glu-.H為-Gly-.
6.如權(quán)力要求1中所述的化合物，其特征在于，B為-Thr-.C為-Arg-.D為-Ala-.E為-Asp-.F為-Asn-.G為-Glu-.H為-Ile-.
7.如權(quán)力要求1中所述的化合物，其特征在于，B為-Arg-.C為-Arg-.D為-Leu-.E為-Asp-.F為-Asn-.G為-Asp-.H為-Gly-.
8.如權(quán)力要求1中所述的化合物，其特征在于見(jiàn)下式H-Glu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Arg-Leu-Tyr-Asp-Arg-Asn-Asp-Gly-Asp-OH或其鹽的形式，或其復(fù)和物的形式。
9.如權(quán)力要求1中所述的化合物，其特征在于由基團(tuán)組成中選出，見(jiàn)下式H-His-Leu-Glu-Glu-Thr-Tyr-Glu-Glu-Arg-Ala-Tyr-Asp-Arg-Asn-Asp-Ile-Asp-OHH-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Tyr-Glu-Glu-His-Leu-Tyr-Glu-Arg-Asp-Asp-Gly-Asp-OHH-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Tyr-Glu-Glu-His-Leu-Tyr-Glu-Arg-Asp-Asp-Gly-Asp-Lys-Trp-Arg-Asn-Lys-Lys-Phe-OHH-His-Leu-Glu-Glu-Glu-Tyr-Glu-Glu-Glu-Arg-Tyr-Glu-Arg-Gln-Asp-Trp-Asp-OHH-Tyr-Leu-Glu-Glu-Asp-Tyr-Glu-Glu-Glu-Arg-Tyr-Ser-Arg-Gln-Asp-Trp-Asp-OH或其鹽的形式，或其復(fù)和物的形式。
10.權(quán)力要求1中要求保護(hù)的多肽，或其藥物可以接受的鹽的形式或復(fù)合物的形式，及其與藥物可以接受的稀釋劑和載體一起使用所形成的復(fù)合物。特別是對(duì)治療和預(yù)防血吸蟲(chóng)病有作用的藥物，尤其是用其制成的抗血吸蟲(chóng)病的疫苗類(lèi)藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于有機(jī)化合物。具有下列基本序列的多肽X-Glu-Y-Tyr-Glu-Glu-Z-Tyr-U-Arg-V-Asp-W此式中X，Y，Z，U，V，W均為氨基酸殘基，該肽對(duì)血吸蟲(chóng)病有保護(hù)性免疫作用，可用于制備抗血吸蟲(chóng)病的疫苗類(lèi)藥物。
文檔編號(hào)A61K38/10GK1112930SQ9410597
公開(kāi)日1995年12月6日 申請(qǐng)日期1994年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月8日
發(fā)明者許家喜, 蔡孟深 申請(qǐng)人:北京醫(yī)科大學(xué)