專利名稱：一種地龍注射制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地龍注射制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
地龍，Lumbrricus，本品為矩蚓科動物參環(huán)毛蚓或縞蚯蚓的干燥體。前者產(chǎn)于廣東、廣西，稱“廣地龍”，后者產(chǎn)于河南、山東、江蘇，稱“土地龍”。別名，蚯蚓、蛐蟮、土龍，主要成分含蚯蚓解熱堿(Lum-brofebrine)、蚯蚓素(Lumbrilin)、蚯蚓毒素(Terrestro-Lumbroly-sin)，氨基酸類、嘌呤類、膽堿、脂肪酸等，性咸，寒，歸肝、脾、肺經(jīng)，主要作用為清熱，定驚，止喘，利尿，具有有解熱、降壓、舒張支氣管、解除痙攣?zhàn)饔茫R床用于高血壓、支氣管哮喘、高熱抽搐、偏癱、半身不遂、腮腺炎、丹毒、帶狀皰疹、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、泌尿系感染、小兒百日咳等。
現(xiàn)代中藥藥理研究，地龍制劑在臨床應(yīng)用過程中，容易產(chǎn)生一系列的過敏反應(yīng)，其主要原因是地龍的有效成分、致敏成分都是一些多肽類成分，性質(zhì)相近，在制備過程中會被同時提取出來，在應(yīng)用過程中遇到敏感體制的人群就很容易發(fā)生過敏反應(yīng)，給醫(yī)生和患者帶來很多的麻煩，因此去除地龍中有毒成分是很多科研工作者的急需研究的課題。
地龍生長的環(huán)境為土壤，其主要的食原為土壤中的腐敗有機(jī)物，而這些物質(zhì)中含有大量的重金屬，也會隨之進(jìn)入地龍的體內(nèi)，這就需要在制備地龍制劑中一定要對重金屬進(jìn)行含量限定。
中國專利局2000年4月12日公告的《活性地龍干粉的制備方法》專利申請，該專利申請公開了一種制備地龍凍干粉的方法，該方法是通過將鮮活地龍冼凈后凍成冰塊，然后放在鹽水溶液中溶解，并自溶攪拌成漿，得到的勻漿液至少進(jìn)行一次離心處理后，將上清液進(jìn)行預(yù)過濾滅菌和超過濾濃縮后得干粉，但該方法制成的地龍凍干粉的活性較低；申請?zhí)枮?2129969.2的專利《高活性蚓激酶干粉的制備方法》，該制備方法中加入聚丙烯酸鈉溶液進(jìn)行純化，得到的有效部位沒有進(jìn)行活性檢測，因此其有效成分的活性需要進(jìn)行推敲；申請?zhí)枮?3146692的專利文獻(xiàn)采用超濾、陰離子交換、凝膠過濾的方法制備蚓激酶，該方法操作復(fù)雜，實(shí)際生產(chǎn)中生產(chǎn)成本較大；申請?zhí)枮?2153848的專利文獻(xiàn)采用的陰離子交換、疏水柱層析的方法得到地龍3個活性成分，該方法沒有將地龍的活性部位提取完全，工業(yè)化具有一定困難；申請?zhí)枮?2129969的專利文獻(xiàn)采用的是鹽析和超濾的方法得到蚓激酶，該方法得到的蚓激酶純度不高，從而導(dǎo)致活性不高；申請?zhí)枮?2116271的專利文獻(xiàn)采用親和色譜法得到蚓激酶，該方法不適合工業(yè)化生產(chǎn)；申請?zhí)?3146692的專利文獻(xiàn)通過鹽析的方法得到蚓激酶，該方法得到的蚓激酶純度不高、活性不好；申請?zhí)枮?9112806的專利文獻(xiàn)采用的鹽析和離心的方法得到蚓激酶，該方法得到蚓激酶純度不高、活性不好。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述原因，本發(fā)明用6％-8％的氯化鈉對地龍進(jìn)行處理，除去地龍毒素，采用生理鹽水浸泡、超濾、離子交換有機(jī)結(jié)合的方法，得到有效部位，制備成注射制劑，控制重金屬含量低于5PPM。藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明工藝操作簡單可行，易于工業(yè)化生產(chǎn)，本發(fā)明地龍注射制劑具有很好的藥理作用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
一.工藝制法(1)取地龍，加入6％-8％的氯化鈉浸泡，清洗3-5次，去除黃色黏液物質(zhì)，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{，加入滅菌生理鹽水，充分搖勻后，放置4℃冰箱過夜，經(jīng)浸泡的生理鹽水進(jìn)行離心，在4℃以5000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，得到上清液；
(2)將上清液用截留分子量為8000-10000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，留循環(huán)液，濃縮到20℃時相對密度為1.05-1.10的濃縮液；(3)將超濾液用緩沖液調(diào)pH值為5.0-7.0，分別將超濾液經(jīng)過CM-sephadexC25離子交換凝膠色譜柱和sephadex G50離子交換凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱的流動相用緩沖液調(diào)pH至6.0-7.0進(jìn)行洗脫，sephadex G50離子交換凝膠色譜柱的流動相用緩沖液調(diào)pH至7.0-8.0進(jìn)行梯度洗脫；收集單一組分，將各個單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，并留樣檢測，得到地龍多肽半成品，仍凍存于-20℃冰柜中，得到提取物洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；(4)制劑的制備制劑處方為地龍有效部位25-35重量份，藥用輔料65-75重量份水針劑將半成品，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝，檢測，得到地龍水針劑。
輸液劑將半成品加入葡萄糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝，檢測。得到地龍輸液劑。
粉針劑將半成品加入藥用輔料，用注射用水調(diào)整濃度，分裝到西林瓶中，干燥，檢測，得到地龍粉針劑。
本發(fā)明提供一種易于工業(yè)化生產(chǎn)的提取純化地龍有效部位蚓激酶的工藝方法；本發(fā)明還在于提供一種毒副作用小、藥理作用更好地龍的注射制劑；本發(fā)明提供一種地龍注射制劑在心腦血管疾病中的應(yīng)用。
二、質(zhì)量檢測1.蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)藥物本專利地龍有效部位(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)
實(shí)驗(yàn)方法采用BCA法，在562nm處進(jìn)行測量實(shí)驗(yàn)結(jié)果O.D值0.667蛋白質(zhì)含量555毫克/毫升2.纖維蛋白原-凝血酶結(jié)合物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)藥物本專利地龍有效部位((廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1表1 纖維蛋白原-凝血酶結(jié)合物實(shí)驗(yàn)

注+陽性，+-弱陽性，-陰性結(jié)論比活性1∶803.重金屬檢測按照《中華人民共和國藥典》(2005年二部附錄VIIIH重金屬檢查法)進(jìn)行分析，測得本專利注射制劑的重金屬含量為3.8PPM。
4.檢測分析采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測分析實(shí)驗(yàn)儀器waters600E型高效液相色譜儀，996PDA檢測器；色譜柱日本TOSOH TSK2000SW 7.5×300；色譜條件工作站millennium chromatograph；波長280nm；流動相0.01mol/L、pH值6.68的磷酸緩沖溶液(配制方法按照中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)2000年版，中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)委員會編，化學(xué)工業(yè)出版社，P13-14配制)。
2.實(shí)驗(yàn)藥物地龍多肽樣品為本發(fā)明工藝制備的地龍多肽(廣州天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室)。
3.樣品制備取樣品，用多肽純化離心管，進(jìn)行離心分離，取離心液體即為樣品。
4.上樣取上述處理的樣品用微量注射器吸取定量液體，注入進(jìn)樣器進(jìn)行檢測。
5.結(jié)果對五批樣品進(jìn)行測定，采用歸一化法計(jì)算地龍蚓激酶占有效成分含量為91.8％。
三.藥理實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1地龍有效部位活性檢測實(shí)驗(yàn)材料5g/L纖維蛋白原的生理鹽水溶液，注射用生理鹽水(廣州天之驕藥物開發(fā)有限公司)冷凍干燥凝血酶(安徽桑原生物技術(shù)研究所購買，每瓶含量為500IU，用時用生理鹽水稀釋至每毫升含凝血酶0.5IU)3.待測樣品地龍有效部位樣品為本發(fā)明工藝制備(廣州天之驕藥物開發(fā)有限公司提供)檢測方法取10×80mm試管8支，在每支試管中加入生理鹽水0.2ml(第一管不加)，于第一管中加入待測樣品0.2ml；第二管中加入0.2ml，充分混勻后吸取0.2ml加入第三管，以次例推，直至加到第7管，將多余的0.2ml混合液廢棄，此時各試管都為0.2ml，但濃度依次為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶80、1∶160，第7管因不含有效部位，作為試驗(yàn)對照，加樣結(jié)束后，放到37℃水浴使樣品與凝血酶作用5-10min，再于各試管中加入5g/l纖維蛋白原溶液0.2ml，再放入37℃水浴，觀察記錄1-24小時結(jié)果，并進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法為發(fā)生凝固或沉淀的試管為無抗凝血酶活性(陰性)，不凝固或無沉淀產(chǎn)生的試管為具有抗凝血酶活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過計(jì)算本發(fā)明的地龍有效部位的比活性為1∶80。
實(shí)驗(yàn)2抑制血小板聚集的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠，體重200-250g，雌雄各半。
實(shí)驗(yàn)藥物市售疏血通注射液(牡丹江友博藥業(yè)有限責(zé)任公司)；本發(fā)明地龍注射制劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)；生理鹽水實(shí)驗(yàn)方法取大鼠，分為本發(fā)明地龍水針劑劑組、輸液組、粉針劑組、市售疏血通注射液組、生理鹽水組，給藥劑量30mg/kg，生理鹽水等容不等量2次/日，次日給藥1次后用1％戊巴比妥鈉(劑量05ml/100g)腹腔注射麻醉。按文獻(xiàn)(朱益棟主編彌散性血管內(nèi)凝血北京人民衛(wèi)生出版社，1982；279 293)的方法復(fù)制大鼠高凝血癥模型。復(fù)制模型后即刻從頸動脈取血3ml，38％枸櫞酸鈉抗凝(1∶10)，制成富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)，計(jì)算血小板凝集率，血小板聚集率用SPA-4型血小板聚集儀測定，促聚劑用二磷酸腺苷，(ADP)，濃度10μmol/L。測定指標(biāo)有一分鐘聚集率(A1，)、最大聚集率(Amax)和最大聚集時間(Tmax)。見表2表2 不同制劑血小板凝集率的比較

注與生理鹽水組比較**P＜0.01，與陽性對照組比較#P＜0.05實(shí)驗(yàn)3
利用血栓法測定對大白鼠血栓形成的影響。
實(shí)驗(yàn)藥物市售疏血通注射液(牡丹江友博藥業(yè)有限責(zé)任公司)；本發(fā)明地龍注射制劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)；生理鹽水實(shí)驗(yàn)動物體重300-400克的大白鼠30只，雌雄不分。
實(shí)驗(yàn)方法將大鼠分組分為本發(fā)明地龍水針劑劑組、輸液組、粉針劑組、市售疏血通注射液組、生理鹽水組，分別給藥，給藥劑量30mg/kg，生理鹽水等容不等量，給藥后將大白鼠麻醉(戊巴比妥鈉30-40mg/kg，ip)，仰臥位固定，分離氣管，插入一塑料套管，并分離右頸總動脈及左頸外靜脈，在聚乙烯管的中段放入一根長6厘米的絲線，以肝素生理鹽水溶液，充滿聚乙烯管，當(dāng)聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后，由聚乙烯管準(zhǔn)確的注入肝素抗凝，然后再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈，打開動脈夾，血液從右頸總動脈流至聚乙烯管，返回左頸外靜脈，開放血流15分鐘后斷血流，迅速取出絲線稱重，總重量減去絲線重量即得血栓重量。將空白組和另給藥組的動物血栓濕重進(jìn)行記錄，進(jìn)行計(jì)算，如表3所示表3 各給藥組的血栓重量

注與生理鹽水組比較**P＜0.01，與陽性對照組比較#P＜0.05實(shí)驗(yàn)4對小鼠ADP誘導(dǎo)的血栓性死亡的影響實(shí)驗(yàn)藥物市售疏血通注射液(牡丹江友博藥業(yè)有限責(zé)任公司)；本發(fā)明地龍注射制劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)；生理鹽水實(shí)驗(yàn)方法取健康小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分組本發(fā)明地龍水針劑劑組、輸液組、粉針劑組、市售疏血通注射液組、生理鹽水組，每日尾靜脈給藥，給藥量39mg/kg，連續(xù)7d，于末次給藥后1h尾靜脈注射ADP48.0ml/kg，記錄動物死亡情況。
見表4表4 各組制劑對小鼠ADP誘導(dǎo)的血栓性死亡的影響比較

結(jié)論通過藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明地龍注射制劑具有更好的藥理作用。
四、制備實(shí)施例實(shí)施例1(1)取地龍，加入6％的氯化鈉浸泡，清洗3次，去除黃色黏液物質(zhì)，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{，加入滅菌生理鹽水，充分搖勻后，放置4℃冰箱過夜，經(jīng)浸泡的生理鹽水進(jìn)行離心，在4℃以5000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，得到上清液；(2)將上清液用截留分子量為8000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，留循環(huán)液，濃縮到20℃時相對密度為1.05的濃縮液；(3)將超濾濃縮液液用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值為5.0，將超濾濃縮液經(jīng)過CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱和sephadex G50離子交換凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化，CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱的流動相用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至6.0進(jìn)行洗脫，sephadex G50離子交換凝膠色譜柱的流動相用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至7.0進(jìn)行梯度洗脫；收集單一組分，將各個單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，并留樣檢測，得到地龍多肽半成品，仍凍存于-20℃冰柜中，得到提取物洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；地龍蚓激酶占有效部位的含量85.0％(4)制劑的制備制劑處方為地龍有效部位25克，藥用輔料75克。
水針劑將半成品，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝，檢測，得到地龍水針劑1000平。
輸液劑將半成品加入葡萄糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝，檢測。得到地龍輸液劑1000瓶。
粉針劑將半成品加入藥用輔料蔗糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝到西林瓶中，干燥，檢測，得到地龍粉針劑1000瓶。
實(shí)施例2(1)取地龍，加入8％的氯化鈉浸泡，清洗5次，去除黃色黏液物質(zhì)，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{，加入滅菌生理鹽水，充分搖勻后，放置4℃冰箱過夜，經(jīng)浸泡的生理鹽水進(jìn)行離心，在4℃以5000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，得到上清液；(2)將上清液用截留分子量為10000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，留循環(huán)液，濃縮到20℃時相對密度為1.10的濃縮液；(3)將超濾濃縮液用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液調(diào)pH值為7.0，將超濾濃縮液經(jīng)過CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱和sephadex G50離子交換凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱的流動相用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液調(diào)pH至7.0進(jìn)行洗脫，sephadex G50離子交換凝膠色譜柱的流動相用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液調(diào)pH至8.0進(jìn)行梯度洗脫；收集單一組分，將各個單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，并留樣檢測，得到地龍多肽半成品，仍凍存于-20℃冰柜中，得到提取物洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；地龍蚓激酶占有效部位的含量95.0％(4)制劑的制備制劑處方為地龍有效部位35克，藥用輔料65克水針劑將半成品，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝，檢測，得到地龍水針劑1000瓶。
輸液劑將半成品加入葡萄糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝，檢測。得到地龍輸液劑1000瓶。
粉針劑將半成品加入藥用輔料乳糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝到西林瓶中，干燥，檢測，得到地龍粉針劑1000瓶。
實(shí)施例3(1)取地龍，加入7％的氯化鈉浸泡，清洗4次，去除黃色黏液物質(zhì)，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{，加入滅菌生理鹽水，充分搖勻后，放置4℃冰箱過夜，經(jīng)浸泡的生理鹽水進(jìn)行離心，在4℃以5000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，得到上清液；(2)將上清液用截留分子量為8000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，留循環(huán)液，濃縮到20℃時相對密度為1.08的濃縮液；(3)將超濾濃縮液用磷酸鹽緩沖液緩沖液調(diào)pH值為6.0，分分別將超濾濃縮液經(jīng)過CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱和sephadex G50離子交換凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱的流動相用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至6.5進(jìn)行洗脫，sephadex G50離子交換凝膠色譜柱的流動相用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至7.5進(jìn)行梯度洗脫；收集單一組分，將各個單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，并留樣檢測，得到地龍多肽半成品，仍凍存于-20℃冰柜中，得到提取物洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；地龍蚓激酶占有效部位的含量92.1％(4)制劑的制備制劑處方為地龍有效部位28克，藥用輔料72克水針劑將半成品，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝，檢測，得到地龍水針劑1000瓶。
輸液劑將半成品加入葡萄糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝，檢測。得到地龍輸液劑1000瓶。
粉針劑將半成品加入藥用輔料甘露醇，用注射用水調(diào)整濃度，分裝到西林瓶中，干燥，檢測，得到地龍粉針劑1000瓶。
實(shí)施例4(1)取地龍，加入6％的氯化鈉浸泡，清洗3次，去除黃色黏液物質(zhì)，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{，加入滅菌生理鹽水，充分搖勻后，放置4℃冰箱過夜，經(jīng)浸泡的生理鹽水進(jìn)行離心，在4℃以5000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，得到上清液；(2)將上清液用截留分子量為10000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，留循環(huán)液，濃縮到20℃時相對密度為1.06的濃縮液；(3)將超濾濃縮液用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液調(diào)pH值為5.5，分別將超濾濃縮液經(jīng)過CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱和sephadex G50離子交換凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱的流動相用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液調(diào)pH至6.2進(jìn)行洗脫，sephadex G50離子交換凝膠色譜柱的流動相用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液調(diào)pH至7.3進(jìn)行梯度洗脫；收集單一組分，將各個單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，并留樣檢測，得到地龍多肽半成品，仍凍存于-20℃冰柜中，得到提取物洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；地龍蚓激酶占有效部位的含量83.9％(4)制劑的制備制劑處方為地龍有效部位30克，藥用輔料70克水針劑將半成品，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝，檢測，得到地龍水針劑1000瓶。
輸液劑將半成品加入葡萄糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝，檢測。得到地龍輸液劑1000瓶。
粉針劑將半成品加入藥用輔料蔗糖、乳糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝到西林瓶中，干燥，檢測，得到地龍粉針劑1000瓶。
實(shí)施例5(1)取地龍，加入8％的氯化鈉浸泡，清洗5次，去除黃色黏液物質(zhì)，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{，加入滅菌生理鹽水，充分搖勻后，放置4℃冰箱過夜，經(jīng)浸泡的生理鹽水進(jìn)行離心，在4℃以5000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，得到上清液；(2)將上清液用截留分子量為10000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，留循環(huán)液，濃縮到20℃時相對密度為1.09的濃縮液；(3)將超濾濃縮液用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值為6.5，分別將超濾濃縮液經(jīng)過CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱和sephadex G50離子交換凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱的流動相用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至6.9進(jìn)行洗脫，sephadex G50離子交換凝膠色譜柱的流動相用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至7.8進(jìn)行梯度洗脫；收集單一組分，將各個單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，并留樣檢測，得到地龍多肽半成品，仍凍存于-20℃冰柜中，得到提取物洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；地龍蚓激酶占有效部位的含量92.0％(4)制劑的制備制劑處方為地龍有效部位32克，藥用輔料68克水針劑將半成品，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝，檢測，得到地龍水針劑1000瓶。
輸液劑將半成品加入葡萄糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝，檢測。得到地龍輸液劑1000瓶。
粉針劑將半成品加入藥用輔料蔗糖、甘露醇，用注射用水調(diào)整濃度，分裝到西林瓶中，干燥，檢測，得到地龍粉針劑1000瓶。
實(shí)施例6(1)取地龍，加入7％的氯化鈉浸泡，清洗4次，去除黃色黏液物質(zhì)，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{，加入滅菌生理鹽水，充分搖勻后，放置4℃冰箱過夜，經(jīng)浸泡的生理鹽水進(jìn)行離心，在4℃以5000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，得到上清液；(2)將上清液用截留分子量為10000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，留循環(huán)液，濃縮到20℃時相對密度為1.07的濃縮液；(3)將超濾濃縮液用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值為6.0，分別將超濾濃縮液經(jīng)過CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱和sephadex G50離子交換凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱的流動相用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至6.3進(jìn)行洗脫，sephadex G50離子交換凝膠色譜柱的流動相用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至7.9進(jìn)行梯度洗脫；收集單一組分，將各個單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，并留樣檢測，得到地龍多肽半成品，仍凍存于-20℃冰柜中，得到提取物洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；地龍蚓激酶占有效成分的含量91.7％(4)制劑的制備制劑處方為地龍有效部位34克，藥用輔料66克水針劑將半成品，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝，檢測，得到地龍水針劑1000瓶。
輸液劑將半成品加入葡萄糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝，檢測。得到地龍輸液劑1000瓶。
粉針劑將半成品加入藥用輔料甘露醇、乳糖、蔗糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝到西林瓶中，干燥，檢測，得到地龍粉針劑1000瓶。
權(quán)利要求
1.一種地龍注射制劑，其特征在于它是由從地龍?zhí)崛〖兓挠行Р课?5-35重量份，藥用輔料65-75重量份制備成的；其特征還在于有效部位中地龍蚓激酶含量為80％-95％，重金屬含量低于5PPM。其特征還在于注射制劑包括水針劑、輸液劑、粉針劑。
2.一種地龍注射制劑的制備方法，其特征包括以下步驟(1)取地龍，加入6％-8％的氯化鈉浸泡，清洗3-5次，去除黃色黏液物質(zhì)，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機(jī)充分?jǐn)囁槭钩纱种苿驖{，加入滅菌生理鹽水，充分搖勻后，放置4℃冰箱過夜，經(jīng)浸泡的生理鹽水進(jìn)行離心，在4℃以5000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，得到上清液；(2)將上清液用截留分子量為8000-10000的中空纖維柱進(jìn)行超濾，保留循環(huán)液，濃縮到20℃時相對密度為1.05-1.10的濃縮液；(3)將超濾濃縮液用緩沖液調(diào)pH值為5.0-7.0，將超濾超濾液經(jīng)過A離子交換凝膠色譜柱和B離子交換凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化A離子交換凝膠色譜柱的流動相用緩沖液調(diào)pH至6.0-7.0進(jìn)行洗脫，B離子交換凝膠色譜柱的流動相用緩沖液調(diào)pH至7.0-8.0進(jìn)行梯度洗脫；收集單一組分，將各個單一組分分別進(jìn)行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，并留樣檢測，得到地龍有效部位半成品，仍凍存于-20℃冰柜中，得到提取物洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；(4)制劑的制備水針劑將半成品，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝，檢測，得到地龍水針劑。輸液劑將半成品加入葡萄糖，用注射用水調(diào)整濃度，分裝，檢測。得到地龍輸液劑。粉針劑將半成品加入藥用輔料，用注射用水調(diào)整濃度，分裝到西林瓶中，干燥，檢測，得到地龍粉針劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種地龍注射制劑的制備方法中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCL)的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種地龍注射制劑的制備方法中A離子交換凝膠色譜柱為CM-sephadex C25離子交換凝膠色譜柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種地龍注射制劑的制備方法中B離子交換凝膠色譜柱為sephadex G50離子交換凝膠色譜柱。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種地龍注射制劑及其制備方法，其特征在于從地龍?zhí)崛∮行Р课?，純化后加入藥用輔料，制備成地龍注射制劑；其特征還在于本發(fā)明采用6％－8％氯化鈉對地龍進(jìn)行處理，除去地龍毒素，采用生理鹽水浸泡、超濾、離子交換有機(jī)結(jié)合的方法，得到有效部位，制備成注射制劑，控制重金屬含量低于5PPM，藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明各組制劑具有很好的安全性，與同類品種比較具有更好的藥理作用。
文檔編號A61P9/12GK1891235SQ20051008031
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日
發(fā)明者張晴龍 申請人:張晴龍