專利名稱：：綠原酸在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及綠原酸的新用途，具體地來說，是綠原酸在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅人類生命健康?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺癌是一種由細(xì)胞突變所致的克隆性疾病，在肺癌組織中，通常有一種惡性細(xì)胞占主要地位。從生物學(xué)行為的角度可將其分為小細(xì)胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)兩種主要類型，其中SCLC約占15%20%。SCLC和NSCLC不僅在染色體、基因、細(xì)胞表面標(biāo)記等細(xì)胞分子水平存在顯著差異，在病理特征方面也存在顯著差異。具體差異如下一、細(xì)胞分子水平差異1.染色體變異肺癌中已報(bào)道多種染色體畸變，包括整條染色體和部分染色體的丟失等，在SCLC染色體畸變主要發(fā)生在lp、3p、5q、6q、8q、13q和17p。和非小細(xì)胞肺癌NSCLC相比較而言，SCLC常常表現(xiàn)出3p、5q、13q和17p，其中最為常見的的染色體畸變是3p的丟失。2.基因異常表達(dá)或缺失myc原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種核DNA結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。myc基因異常表達(dá)的頻率在NSCLC較低，而在SCLC中則存在差異，其表達(dá)的增高則SCLC的預(yù)后較差。BCL家族蛋白是細(xì)胞程序性死亡或凋亡中重要的調(diào)控子，是細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控子，它通過延長細(xì)胞的生存期來抑制細(xì)胞的凋亡。BCL在SCLC中的表達(dá)遠(yuǎn)比NSCLC高，BCL表達(dá)在抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也可增加腫瘤細(xì)胞對一些抗癌藥物的耐受性。SCLC易產(chǎn)生耐藥性與該基因的過表達(dá)有關(guān)。Rb基因的缺失或改變，在NSCLC和SCLC中有很大不同，超過卯。/。的SCLC中Rb基因的缺失或改變，而在NSCLC中僅占15。/。，Rb基因的缺失或改變與癌癥預(yù)后不良密切相關(guān)。3.細(xì)胞表面標(biāo)記SCLC細(xì)胞表面表達(dá)的經(jīng)典分子之一是神經(jīng)粘附分子(NCAM)，粘附分子在細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)聯(lián)系中發(fā)揮著重要作用。并且，在異常狀態(tài)下，對于細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移也發(fā)揮作用。一些研究表明100n/。的SCLC呈現(xiàn)NCAM抗體陽性，而僅9n/。的NSCLC與該抗體反應(yīng)陽性。二、病理特征差異SCLC與NSCLC比較,腫瘤倍增時(shí)間短,惡性程度高，較早出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移和侵入血管經(jīng)血道廣泛轉(zhuǎn)移到身體遠(yuǎn)處器官組織。對放射治療及/或抗癌藥物治療敏感度高，但易產(chǎn)生耐藥性。且由于常短期內(nèi)復(fù)發(fā),生存率低于NSCLC。正是由于上述SCLC與NSCLC的細(xì)胞分子水平和病理特征差異，因此全身化療為SCLC治療的重點(diǎn)。盡管80G/。90M的局限期與約70。/。的廣泛期患者接受細(xì)胞毒藥物化療后腫瘤得以緩解,但緩解期通常不持久(中位緩解期多為6至8個(gè)月),且高達(dá)95%的患者最終將因疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡。目前，無論局限期或廣泛期小細(xì)胞肺癌的主要治療模式均為聯(lián)合化療。根治性化療可以延長患者的生存期,即便對于伴有嚴(yán)重臟器功能損害的患者,姑息性化療也有助于緩解癥狀。因此開發(fā)高效低毒的化療藥物用于SCLC具有非常大的臨床意義。綜上所述，按生物學(xué)行為的角度區(qū)分兩種肺癌是相當(dāng)重要的，因?yàn)檫@兩種類型的肺癌存在明顯差異，發(fā)病機(jī)理、治療方案是截然不同的。小細(xì)胞肺癌患者主要用放化療方法治療，外科治療對這種類型肺癌患者并不起主要作用。另一方面，外科治療主要適用于非小細(xì)胞肺癌患者。小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，相互之間不存在可推導(dǎo)性。另外，大多數(shù)藥物對不同類別的腫瘤細(xì)胞的作用是有一定的專屬性，如臨床常見的紫杉醇在治療肺癌時(shí)是針對非小細(xì)胞癌(勞永聰，紫杉醇治療非小細(xì)胞肺癌毒副作用的觀察與護(hù)理，醫(yī)學(xué)文選2006第二期)，但沒有文獻(xiàn)報(bào)道公開紫杉醇對小細(xì)胞癌也有功效；吉林柳河方大制藥有限公司生產(chǎn)的"參蟾消解膠囊"中藥抗癌藥的功能主治為肺腺癌[見"參蟾消解膠囊"說明書]，肺腺癌屬于非小細(xì)胞癌類。綠原酸是廣泛存在于各種植物中的重要成分，與日常生活相關(guān)的植物包括葵花籽、水果(蘋果、梨、葡萄)、蔬菜(土豆)、大豆、小麥、可可豆、咖啡豆、沙棘果和傳統(tǒng)中草藥(杜仲、金銀花)均不同程度地含有綠原酸。目前報(bào)道的綠原酸用于治療肺癌的報(bào)道較多，如文獻(xiàn)CA143:166218:InhibitionofActivatorProtein-l,NF-B，andMAPKsandInductionofPhase2DetoxifyingEnzymeActivitybyChlorogenicAcid)披露了綠原酸體外抑制人癌癥細(xì)胞株A549的增值。所述癌癥細(xì)胞株A549屬于非小細(xì)胞癌中的肺腺癌。文獻(xiàn)CA100:79562:Protectiveeffectsofellagicacidandotherplantphenolsonbenzo[a]pyrene畫inducedneoplasiainmice.披露了綠原酸(5xl00mg/kg，靜脈注射)抗苯并[a]芘(100mg/kg)導(dǎo)致的肺癌。經(jīng)査閱該文獻(xiàn)，認(rèn)為文獻(xiàn)中表現(xiàn)的也是非小細(xì)胞癌中的肺腺癌(pulmonaryadenoma)。文獻(xiàn)CA141:224381:Invitroantioxidativeeffectsandtyrosinaseinhibitoryactivitiesofsevenhydroxycinnamoylderivativesingreencoffeebeans.披露了從叻卩啡豆中提取得至lj的7種羥基苯丙稀衍生物經(jīng)鑒定其中有綠原酸。這些提取物對MCF7和WI38有抗增值作用。其中MCF7為人乳腺癌細(xì)胞株，WI38人胚肺成纖維細(xì)胞也屬非小細(xì)胞癌。文獻(xiàn)TSNAs的形成、影響因素、分析及清除方法綜述，煙草科技/煙草化學(xué)，2004(7):27-30)披露了TSNAs是一種致癌物質(zhì)，與肺癌產(chǎn)生有關(guān)。綠原酸是TSNAs的抑制劑。間接說明綠原酸的抗肺癌作用。但是文獻(xiàn)所闡述的TSNAs為廣義的致癌物質(zhì)，涉及的肺癌也是一個(gè)廣義概念，或者說是一個(gè)肺癌的上位概念，而且不能說明綠原酸對肺癌的直接作用。綜上所述，現(xiàn)有文獻(xiàn)均披露的綠原酸對肺癌的作用一方面局限于非小細(xì)胞肺癌，沒有綠原酸治療小細(xì)胞肺癌的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了綠原酸的新用途，具體地，是在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。本發(fā)明提供了綠原酸Chlorogenicacid在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種治療肺癌的藥物組合物，它是以有效量的綠原酸為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。其中，所述的藥劑中每制劑單位含有綠原酸1—3000mg。其中，所述的藥劑是口服制劑、注射制劑。雖然文獻(xiàn)報(bào)道綠原酸能夠在體外抑制人癌癥細(xì)胞株A549的增值的非小細(xì)胞肺癌屬，但小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌是屬于肺癌中的兩種不同的類型，是不同的適應(yīng)癥。因此，不能推之具有綠原酸具有抑制小細(xì)胞肺癌的功效。小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌在病因?qū)W、種系發(fā)生學(xué)、組織病理學(xué)和臨床方面有著明顯的不同。小細(xì)胞肺癌(SCLC)在肺癌中所占的比例約2025%，據(jù)近年流行病學(xué)資料顯示該類型已有下降的趨勢。SCLC由肺Kulchitsky細(xì)胞惡變而來，WHO將其又分為燕麥細(xì)胞型、中間細(xì)胞型和混合細(xì)胞型三種。該病男性多發(fā)于女性；發(fā)病部位以大支氣管(中心型)居多。臨床特點(diǎn)為腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間短，進(jìn)展快，常伴內(nèi)分泌異?；蝾惏┚C合征；由于患者早期即發(fā)生血行轉(zhuǎn)移且對放化療敏感，故小細(xì)胞肺癌的治療都采全身化療為主，聯(lián)合放療和手術(shù)為主要治療手段，藥物治療手段不多。本發(fā)明綠原酸對小細(xì)胞肺癌有抑制功效，能替代部分放化療，減輕患者可以因放化療引起的不適反應(yīng)，是治療小細(xì)胞肺癌的新的藥物治療手段和選擇。發(fā)明的具體實(shí)施方式實(shí)施例1制備氯化鈉0.9%的靜脈注射用注射液處方一純度大于95%的綠原酸l.Og枸櫞酸l.Og枸櫞酸鈉0.5g氯化鈉18g注射用水2000ml按注射劑的常規(guī)操作共制成2ml的注射劑1000支，每支含綠原酸l毫克處方二純度大于95%的綠原酸3000g氯化鈉4500g注射用水_500000ml_按注射劑的常規(guī)操作共制成500ml的注射劑1000瓶，每瓶含綠原酸3克防止綠原酸水解的穩(wěn)定劑如環(huán)糊精包合物、表面活性劑(陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、非離子表面活性劑)?？寡趸瘎﹣喠蛩徕c、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、抗壞血酸、生理可用的pH值調(diào)節(jié)劑檸檬酸、富馬酸、谷氨酸、L-天冬氨酸、乳酸、乳糖酸、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、抗壞血酸、鹽酸、醋酸。實(shí)施例2含氯化鈉的無菌粉針劑處方一純度大于95%的綠原酸無菌粉l.Og氯化鈉無菌粉__按無菌粉針劑的常規(guī)操作共制成2ml粉針劑1000支，每支含綠原酸1毫克處方二純度大于95%的綠原酸無菌粉3000g氯化鈉無菌粉__按無菌粉針劑的常規(guī)操作共制成5ml粉針劑1000支，每支含綠原酸3克將實(shí)施例1各配方產(chǎn)品經(jīng)凍干設(shè)備冷凍干燥制得綠原酸氯化鈉的無菌凍干粉針劑。實(shí)施例3綠原酸的5%葡萄糖靜脈注射用注射液處方一綠原酸(純度大于95%)2.0g枸櫞酸l.Og枸櫞酸鈉0.5g葡萄糖100g注射用水2000ml按注射劑的常規(guī)操作共制成2ml的注射劑1000支，每支含綠原酸2毫克處方二綠原酸(純度大于95%)葡萄糖注射用水20000ml1500g1000g按注射劑的常規(guī)操作共制成20ml的注射劑1000支，每支含綠原酸1.5克處方三按注射劑的常規(guī)操作共制成500ml的注射劑1000瓶，每瓶含綠原酸3克綠原酸的純度大于95%。防止綠原酸水解的穩(wěn)定劑如環(huán)糊精包合物、表面活性劑(陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、非離子表面活性劑)抗氧化劑亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、抗壞血酸、半胱氨酸。生理可用的pH值調(diào)節(jié)劑檸檬酸、富馬酸、谷氨酸、L-天冬氨酸、乳酸、乳糖酸、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、抗壞血酸、鹽酸、醋酸。實(shí)施例4綠原酸片劑綠原酸(純度大于95%)葡萄糖注射用水3000g25000g500000ml處方--:綠原酸(純度大于95%)l.OOg填充劑180.00g崩解劑10.00g黏合劑6.00g潤滑劑3.00g共計(jì)__200.00g按片劑常規(guī)方法制備，共制成1000片，每片含綠原酸lmg。綠原酸(純度大于95%)100.00g填充劑170.00g崩解劑15.00g黏合劑10.00g潤滑劑5.00g共i十_300.00g按片劑常規(guī)方法制備，共制成1000片，每片含綠原酸100mg。處方三綠原酸(純度大于95%)300.00g填充劑155.00g崩解劑20.00g黏合劑15.00g潤滑劑lO.OOg共計(jì)__500.00g按片劑常規(guī)方法制備，共制成1000片，每片含綠原酸300mg。綠原酸的純度大于95%。填充劑如淀粉、糊精、糖粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、葡萄糖、微晶纖維素、碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈣。黏合劑如羥丙甲纖維素、聚維酮、淀粉漿、糊精漿、糖漿、膠槳、海藻酸鈉、聚乙二醇、桃膠、阿拉伯膠。崩解劑如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、羧甲淀粉鈉、羥丙基淀粉、低取代羥丙基纖維素、梓檬酸、酒石酸、酸酐、碳酸氫鈉、碳酸鈉。潤滑劑如硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、液體石蠟、聚乙二醇。實(shí)施例5綠原酸膠囊劑處方一綠原酸(純度大于95%)1.00g填充劑184.00g黏合劑5.00g潤滑劑lO.OOg共計(jì)200.00g按膠囊劑常規(guī)方法制備，共制成1000粒膠囊，每粒膠囊含綠原酸lmg。處方二綠原酸(純度大于95%)100.00g填充劑85.00g黏合劑5.00g潤滑劑lO.OOg共計(jì)200.00g按膠囊劑常規(guī)方法制備，共制成1000粒膠囊，每粒膠囊含綠原酸lOOmg。處方綠原酸(純度大于95%)300.00g填充劑85.00g黏合劑5.00g潤滑劑lO.OOg共計(jì)400.00g按膠囊劑常規(guī)方法制備，共制成1000粒囊，每粒膠囊含綠原酸300mg。綠原酸的純度大于95%。填充劑如淀粉、糊精、糖粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、葡萄糖、微晶纖維素、碳酸鈣、硫酸朽、碳酸氫鈣。黏合劑如羥丙甲纖維素、聚維酮、淀粉漿、糊精漿、糖漿、膠漿、海藻酸鈉、聚乙二醇、桃膠、阿拉伯膠。潤滑劑如硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、液體石蠟、聚乙二醇。以下通過藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例l綠原酸體外抗腫瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)下述試驗(yàn)從小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩個(gè)類別方面進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)證明了綠原酸具有的治療肺癌的作用，更全面和完整地說明了綠原酸能治療小細(xì)胞肺癌。一、藥物及主要試劑耗材1、綠原酸粉劑，純度99.6%，由四川大學(xué)藥學(xué)院提供，分子量354。2、培養(yǎng)基及試劑培養(yǎng)基RPML1640(Gibco公司)，小牛血清(蘭州民海)，青霉素(華北制藥股份有限公司，批號E0509104)、硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司，批號No細(xì)302)，MTT(Sigma公司)。3、培養(yǎng)器皿96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶(BD公司)。4、儀器日本SANYO二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，Olympus1X70倒置相差熒光顯微鏡，美國NUAIRE生物安全柜，p-Quant微孔板測定儀(BioTek公司)。5、細(xì)胞株人肺腺癌(SP-CA-1);人小細(xì)胞肺癌(NCIH446)。從中科院上海細(xì)胞庫和ATCC引進(jìn)，實(shí)驗(yàn)室保存。二、實(shí)驗(yàn)歩驟(一)藥物及試劑配制1、綠原酸的配制綠原酸粉劑用超純水(18.2MQ/cm水質(zhì)，Millipore-Q制備)溶解配成6.4mg/ml的儲存濃度，經(jīng)0.22pmMillipore無菌過濾頭無菌過濾除菌。2、培養(yǎng)液配置RPML1640粉劑溶解于超純水中，攪拌溶解，力n2.2gNaHC03、10mMHEPES攪拌溶解，加青霉素100U/ml、鏈霉素100|ug/ml，充分混合后0.22pm濾膜無菌過濾，分裝-20'C凍存，此為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。臨用前37'C水浴解凍，加10%的小牛血清，調(diào)整培養(yǎng)液pH為7.27.4，此為完全培養(yǎng)基。3、CellProliferationReagent(WST-1)(Roche11644807001)按要求冷藏。(二)細(xì)胞復(fù)蘇及接種1、細(xì)胞復(fù)蘇將凍存細(xì)胞株從-152"C超低溫冰柜中取出，4(TC水浴解凍，離心用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌后用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，靜置于37"C、5%C02的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每23天換液。細(xì)胞生長鋪滿細(xì)胞瓶后用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)直實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞數(shù)量。2、消化細(xì)胞接種孔板取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、用基礎(chǔ)培養(yǎng)基離心洗滌1000rpm5min兩次，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為6xl0Vml，接種細(xì)胞于%孔板內(nèi)，每孔50pl(細(xì)胞數(shù)量3><103/孔)。接種孔數(shù)以每個(gè)藥物濃度3個(gè)復(fù)孔接種，并設(shè)正常對照組(腫瘤細(xì)胞+完全培養(yǎng)基)，接種培養(yǎng)后次日細(xì)胞貼壁后加藥。設(shè)定空白對照組(完全培養(yǎng)基+實(shí)驗(yàn)終止前同步加等量WST-l)(三)加藥按以下分組加藥，靜置培養(yǎng)48小時(shí)，加藥48小時(shí)后終止前4小時(shí)加WST-1，H-Quant微孔板測定儀(BioTek公司)測定440nm波長的光吸收值。1、綠原酸組加藥前用完全培養(yǎng)基將6.4mg/ml儲存濃度的綠原酸配制成256pg/ml的藥物濃度，然后按兩倍稀釋法逐步稀釋；每個(gè)濃度取50pl2倍終濃度的綠原酸到己接種細(xì)胞的有50pl培養(yǎng)基的相應(yīng)孔板中，綠原酸終濃度即為128、64、32、16、8、4、2禾卩l(xiāng)pg/ml。2、正常對照組設(shè)腫瘤細(xì)胞正常對照組孔與上述同步實(shí)驗(yàn)。3、空白對照組每孔加等量完全培養(yǎng)基，3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)終止前同歩加等量WST-1并同步測定。4、37°C、5%(:02飽和濕度靜置培養(yǎng)48小時(shí)。比色測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4小時(shí)，在上述3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和正常對照組孔板內(nèi)每孔加10)^1WST-1溶液，置37"C細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，于加樣后2、4hr在)i-Quant微孔板測定儀(BioTek公司)上測定不同藥物組和正常對照孔的440nm波長光吸收值。96孔對應(yīng)濃度及數(shù)據(jù)見表1:表1綠原酸體外作用肺癌細(xì)胞的測定值<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>三實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)表一測定結(jié)果，按公式(1)計(jì)算不同濃度綠原酸對人肺腺癌(SP-CA-1);人小細(xì)胞肺癌(NCIH446)的抑制率。抑制率％=a-ODg,—0/)基質(zhì))xioo......i0^正常值_。"基質(zhì)計(jì)算結(jié)果見表2。表2不同濃度綠原酸對肺癌NCIH446和SP-CA-1的抑制結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)論綠原酸體外抑瘤實(shí)驗(yàn)證明，綠原酸高濃度時(shí)對人患肺腺癌(SP-CA-1)和小細(xì)胞肺癌(NCIH446)有抑制作用。上述試驗(yàn)證明，本發(fā)明綠原酸對小細(xì)胞肺癌有抑制功效，能替代部分放化療，減輕患者可以因放化療引起的不適反應(yīng)，是治療小細(xì)胞肺癌的新手段。權(quán)利要求1、綠原酸Chlorogenicacid在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。2、一種治療肺癌的藥物組合物，它是以有效量的綠原酸為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑中每制劑單位含有綠原酸1—3000mg。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是口服制劑、注射制劑。全文摘要本發(fā)明提供了綠原酸Chlorogenicacid在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。本發(fā)明綠原酸對小細(xì)胞肺癌有抑制功效，能替代部分放化療，減輕患者可以因放化療引起的不適反應(yīng)，是治療小細(xì)胞肺癌的新的藥物治療手段和選擇。文檔編號A61P35/00GK101120938SQ20071014060公開日2008年2月13日申請日期2007年8月9日優(yōu)先權(quán)日2006年8月9日發(fā)明者旭包,潔張,徐小平,易大朝申請人:四川九章生物化工科技發(fā)展有限公司