專利名稱：新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于生產(chǎn)亞微米水包油乳液的方法，具體地，涉及亞微米水包油乳液的過(guò)濾。
背景技術(shù)：
生產(chǎn)方法公開(kāi)在0tt等人，2000 (The Adjuvant MF59: A 10-yearPerspective. Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols[Methods in Molecular medicine,第42卷，第 12章，第211-228頁(yè)]，Ott等人，1995(MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines:Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach [Pharmaceutical Biotechnology第 6 卷]Powell 和 Newman 編，W006/100110A1,以及 Lidgate 等人，1992 (SterileFiltration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)?！に腿橐嚎梢宰鳛樽魟┯糜谝呙?免疫原性組合物中。由于這些乳液被施用給人類，所述乳液必須是無(wú)菌的。用作佐劑的水包油乳液是亞微米乳液，且油微滴足夠小以穿過(guò)0. 2Mffl過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供一種用于生產(chǎn)亞微米水包油乳液的方法，尤其是水包油乳液的過(guò)濾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)亞微米水包油乳液的方法，尤其是亞微米水包油乳液的過(guò)濾。本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟
a.制備亞微米水包油乳液；
b.通過(guò)無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，預(yù)過(guò)濾所述水包油乳液；
c.通過(guò)與步驟b)的過(guò)濾器分離的無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟b)濾過(guò)的水包油乳液。
具體實(shí)施例方式水包油乳液，尤其是亞微米水包油乳液，可以用作免疫學(xué)佐劑。腸胃外地施用包含與抗原(諸如流感抗原)相組合的所述水包油乳液的疫苗組合物，因而，所述水包油乳液必須是無(wú)菌的。本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)，為了生產(chǎn)無(wú)菌的亞微米水包油乳液，通過(guò)單個(gè)無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器過(guò)濾乳液是不夠的。本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)，為了提供無(wú)菌的水包油乳液，在用無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器過(guò)濾之前，必須預(yù)過(guò)濾水包油乳液。因此，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟
a.制備亞微米水包油乳液；
b.通過(guò)無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，預(yù)過(guò)濾所述水包油乳液；C.通過(guò)與步驟b)的過(guò)濾器分離的無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟b)濾過(guò)的水包油乳液。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于生產(chǎn)亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟
a.制備亞微米水包油乳液；
b.通過(guò)無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，預(yù)過(guò)濾所述水包油乳液；
c.通過(guò)與步驟b)的過(guò)濾器分離的過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟b)預(yù)濾過(guò)的水包油乳液；和
d.通過(guò)與步驟b)或c)的過(guò)濾器分離的無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟c)濾過(guò)的水包油乳液。 在該具體實(shí)施方案中，在步驟c)中使用的過(guò)濾器可以具有這樣的孔所述孔的大小范圍是從無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器的孔徑(即約O. 至約2Mm的孔徑。具體地，在上述實(shí)施方案中在步驟c)中使用的過(guò)濾器的孔徑范圍是從無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器的孔徑至約IMffl的大小。例如，在步驟b)中使用的過(guò)濾器的孔徑是約2Mm、約2. 5Mm、約IMm、約O. 9Mm、約O. 8Mm、約O. 9Mm、約 O. 7Mm、約 O. 6Mm、約 O. 5Mm、0. 45Mm 或無(wú)菌級(jí),例如約 O. 2Mm,例如 O. 22Mm。亞微米水包油乳液是這樣的水包油乳液其中平均微滴尺寸小于lMm。測(cè)量微滴尺寸的方法是技術(shù)人員眾所周知的，例如動(dòng)態(tài)光散射。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如但不限于高壓勻漿化，例如使用微射流機(jī)，可以生產(chǎn)亞微米水包油乳液。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，亞微米水包油乳液具有小于約220nm (O. 2Mm)、尤其是約120nm至約180nm的平均油微滴尺寸?！盁o(wú)菌級(jí)過(guò)濾器”是指，在大于或等于lxlOVcm2有效過(guò)濾面積的挑戰(zhàn)水平，用微生物挑戰(zhàn)以后，產(chǎn)生無(wú)菌流出液的過(guò)濾器。無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器是本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的，且具有約O. 2Mffl的孔徑，因而包括具有約O. 22ΜΠ1孔徑的過(guò)濾器。所述過(guò)濾器的膜可以由技術(shù)人員已知的任意合適的材料制成，例如，但不限于醋酸纖維素、聚醚砜(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)或所有本發(fā)明的過(guò)濾器膜包含聚醚砜，例如親水性聚醚砜。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了如本文所述的方法，所述方法包括步驟；
a.制備亞微米水包油乳液；
b.預(yù)過(guò)濾所述水包油乳液；
c.通過(guò)無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟b)預(yù)濾過(guò)的水包油乳液；
d.通過(guò)與步驟b)或步驟c)的過(guò)濾器分離的過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟c)濾過(guò)的水包油乳液；
e.通過(guò)與步驟b)、c)和/或d)的過(guò)濾器分離的無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟d)濾過(guò)的水包油乳液。在該具體實(shí)施方案中，在步驟b)和/或步驟d)中使用的過(guò)濾器可以具有這樣的孔所述孔的大小范圍是從無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器(約O. 至約尤其是無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器至約lMm。例如，在步驟b)和/或步驟d)中使用的過(guò)濾器的孔徑是約2Mm、約2. 5Mm、約lMm、約O. 9Mm、約 O. 8Mm、約 O. 9Mm、約 O. 7Mm、約 O. 6Mm、約 O. 5Mm、0. 45Mm 或無(wú)菌級(jí)，例如約 O. 2Mm,例如0.22Mm。在步驟b)和d)中使用的過(guò)濾器可以具有彼此相同的孔隙率，或具有彼此不同的孔徑。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明的方法，其中每個(gè)過(guò)濾器的分壓是約I至約I. 5巴，例如約I巴。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明的方法，其中在約15°C至約30°C、約16°C至約29°C、約17°C至約28°C、約16°C至約27°C、約16°C至約28°C、或22°C ±4°C的溫度進(jìn)行過(guò)濾。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述亞微米水包油乳液包含約2%至約15%、約4%至約12%的油、約5%至約10%、約4%至約6%、約8%至約12%、例如約5%或10% (v/v)的油。為了使任意水包油組合物適合對(duì)人施用，所述油相必須包含可代謝的油(即可生物降解的)。所述油可以是任意植物油、魚油、動(dòng)物油或合成油，其對(duì)受體無(wú)毒，且能夠通過(guò)代謝進(jìn)行轉(zhuǎn)化。堅(jiān)果、種子和谷物是植物油的常見(jiàn)來(lái)源。合成油也是合適的。因此，本發(fā)明的水包油乳液包含可代謝的油，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的水包油乳液包含角鯊烯(例如約4%至6% [v/V]) ο 本發(fā)明的水包油乳液還可以包含母育酚。母育酚是本領(lǐng)域眾所周知的，且描述在EP0382271中。具體地，所述母育酚是α -生育酚或其衍生物，諸如α -生育酚琥珀酸鹽(也稱作維生素E琥珀酸鹽)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了包含角鯊烯(例如約5% [v/v])和α -生育酚(例如約5% [v/v])的本發(fā)明的水包油乳液。本發(fā)明的水包油乳液包含一種或多種表面活性劑。合適的表面活性劑是技術(shù)人員眾所周知的，包括但不限于聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)、脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)、磷脂酰膽堿(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)鯨蠟硬脂酰醚和辛苯昔醇-9 (TRITON X-100)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，水包油乳液包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的水包油乳液包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和其它表面活性劑，尤其是脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述水包油乳液包含可代謝的油(例如角鯊烯)、母育酚(例如α-生育酚)和表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[吐溫80、聚山梨酯80])。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的水包油乳液包含可代謝的油(例如角鯊烯)、表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[聚山梨酯80])和任選的第二種表面活性劑(例如脫水山梨糖醇三油酸酯[司盤85])。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的水包油乳液包含可代謝的油(例如角鯊烯)、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯(12)鯨蠟硬脂酰醚)和疏水性非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[(聚山梨酯80)])或脫水山梨糖醇三油酸酯[司盤85])。在本文中與本發(fā)明的“疫苗組合物”有關(guān)的實(shí)施方案也適用于與本發(fā)明的“免疫原性組合物”有關(guān)的實(shí)施方案，反之亦然。在每種情況下，發(fā)明人在本文中意圖任選地用術(shù)語(yǔ)“由……組成”、“由……構(gòu)成”分別替代術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”。與數(shù)字值ζ有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“約”是指ζ±5%或10%。實(shí)施例方法
乳化方法
通過(guò)混合注射用水、磷酸鹽緩沖鹽水和吐溫，在罐2中制備水相。通過(guò)混合生育酚和角鯊烯，在罐I中制備油相。攪拌兩相，直到得到均質(zhì)。用氮沖洗整個(gè)裝置，以避免生育酚氧化。用膜泵給高壓勻漿器供料。以需要的流量比，一起進(jìn)料兩相。使兩相第I次穿過(guò)高剪切勻漿器，在這里得到粗乳液。然后，與高剪切勻漿器連通地，產(chǎn)物進(jìn)入高壓勻漿器，在這里得到細(xì)乳液。在混合裝置的出口處，將產(chǎn)物收獲在罐3中(第I次穿過(guò))。當(dāng)罐2和I空時(shí)，將·來(lái)自罐3的乳液導(dǎo)向混合裝置的入口，進(jìn)行第2次穿過(guò)。在第2次穿過(guò)結(jié)束時(shí)，將產(chǎn)物收獲在罐2中。當(dāng)罐3空時(shí)，將來(lái)自罐2的乳液導(dǎo)向混合裝置的入口，進(jìn)行第3次穿過(guò)。將乳液收犾在te 3中，并在過(guò)濾以如在氣下保減。過(guò)濾方法
在I巴最大壓力，在18-26°C之間的溫度，在包含組合的O. 5/0. 2Mm膜的2個(gè)除菌過(guò)濾器上進(jìn)行過(guò)濾，持續(xù)最大3小時(shí)的接觸時(shí)間。為了證實(shí)過(guò)濾方法的效率，必須以IO7 CFU/cm2膜的濃度，用懸浮在乳液中的缺陷短波單胞菌(漢i/iffii/wte)挑戰(zhàn)所述過(guò)濾器膜。為了找到最佳構(gòu)造，測(cè)試了幾種裝置。在第一種裝置中，以IO7 CFU /cm2膜的濃度，給所述產(chǎn)品接種缺陷短波單胞菌細(xì)菌，并在I巴最大壓力，在18-26°C之間的溫度，在2個(gè)O. 5/0. 2Mm過(guò)濾器上進(jìn)行過(guò)濾。接種的產(chǎn)品和過(guò)濾器之間的接觸時(shí)間最大為3小時(shí)?；蛘?，首先在O. 5Mm平膜上預(yù)濾所述產(chǎn)品。然后以IO7 CFU /cm2膜的濃度，給所述產(chǎn)品接種缺陷短波單胞菌細(xì)菌，并在I巴最大壓力，在18-26°C之間的溫度，在O. 2Mm或
O.5/0. 2Mm或O. 2/0. 2Mm平膜上進(jìn)行過(guò)濾。接種的產(chǎn)品和過(guò)濾器之間的接觸時(shí)間最大為I. 5小時(shí)。最后，首先在含有O. 5和O. 2Mm過(guò)濾器的封裝體(capsule)上預(yù)濾所述產(chǎn)品。然后以IO7 CFU /cm2膜的濃度，給所述產(chǎn)品接種缺陷短波單胞菌細(xì)菌，并在I巴最大壓力，在18-26°C之間的溫度，在O. 2Mm封裝體上進(jìn)行過(guò)濾。接種的產(chǎn)品和過(guò)濾器之間的接觸時(shí)間最大為3小時(shí)。在所有情況下，在最后一個(gè)除菌膜之后收獲濾液，并在O. 45Mffl收集過(guò)濾器上過(guò)濾整個(gè)體積，以便鑒別缺陷短波單胞菌的存在。將O. 45Mm過(guò)濾器鋪在TSA板上，并在30°C溫育7天。然后在第2、3、4和7天目檢該板。如果觀察到菌落，對(duì)它們計(jì)數(shù)并鑒別。結(jié)果
在沒(méi)有預(yù)濾或使用O. 5Mm預(yù)濾的情況下，在堵塞之前穿過(guò)過(guò)濾器的體積小于達(dá)到19.14 ml/cm2 (滿足IO7 CFU/cm2的BCT要求所需)的目標(biāo)保留體積所需的最小保留體積。當(dāng)使用含有O. 5/0. 2膜的封裝體作為預(yù)濾器進(jìn)行預(yù)濾時(shí)，保留體積增加至最多19. 4 ml/cm2,且根本沒(méi)有觀察到傳代(passage)。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟 a.制備亞微米水包油乳液； b.通過(guò)無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，預(yù)過(guò)濾所述水包油乳液； c.通過(guò)與步驟b)的過(guò)濾器分離的無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟b)濾過(guò)的水包油乳液。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法包括步驟 a.制備亞微米水包油乳液； b.通過(guò)無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，預(yù)過(guò)濾所述水包油乳液； c.通過(guò)與步驟b)的過(guò)濾器分離的過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟b)預(yù)濾過(guò)的水包油乳液；和 d.通過(guò)與步驟b)或c)的過(guò)濾器分離的過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟c)濾過(guò)的水包油乳液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述方法包括步驟； a.制備亞微米水包油乳液； b.預(yù)過(guò)濾所述水包油乳液； c.通過(guò)無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟b)預(yù)濾過(guò)的水包油乳液； d.通過(guò)與步驟b)或步驟c)的過(guò)濾器分離的過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟c)濾過(guò)的水包油乳液； e.通過(guò)與步驟b)、c)和/或d)的過(guò)濾器分離的無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟d)濾過(guò)的水包油乳液。
4.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的方法，其中一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾器膜包含聚醚砜，例如親水性聚醚砜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器具有約O.2Mm、例如O. 22Mm的孔徑。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、4或5中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟c)中使用的過(guò)濾器具有下述孔徑無(wú)菌級(jí)至約2Mm,例如約2Mm、約I. 5Mm、約IMm、約O. 9Mm、約O. 8Mm、約O. 9Mm、約.O. 7Mm、約 O. 6Mm、約 O. 5Mm、0. 45Mm 或無(wú)菌級(jí)，例如約 O. 2Mm,例如 O. 22Mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟b)和/或步驟d)中使用的過(guò)濾器可具有下述孔徑無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器(約O. 至約2Mm，尤其是無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器至約lMffl，例如，約 2Mm、約 2. 5Mm、約 I Mm、約 O. 9Mm、約 O. 8Mm、約 O. 9μηι、約 O. 7Mm、約 O. 6Mm、約 O. 5Mm、.O. 45Mm或無(wú)菌級(jí),例如約O. 2Mm,例如O. 22Mm。
8.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的方法，其中每個(gè)過(guò)濾器的分壓是約I至約I.5巴，例如約I巴。
9.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的方法，其中在15°C至30°C、16°C至29°C、17°C至28°C、16°C至 27°C、16°C至 28°C、或約 22°C ±4°C進(jìn)行過(guò)濾。
10.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含2%至15%(v/v)的油。
11.根據(jù)權(quán)利要求所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含4%至6%(v/v)的油。
12.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含8-12%(v/v)的油。
13.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含角鯊烯和一種或多種表面活性劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含角鯊烯、母育酚和表面活性劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述母育酚是α-生育酚。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80/聚山梨酯80)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含角鯊烯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含角鯊烯、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子表面活性劑和疏水性非離子表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟a.制備亞微米水包油乳液；b.通過(guò)無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，預(yù)過(guò)濾所述水包油乳液；c.通過(guò)與步驟b)的過(guò)濾器分離的無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器，過(guò)濾根據(jù)步驟b)濾過(guò)的水包油乳液。
文檔編號(hào)A61K47/22GK102917688SQ201180028503
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者V.德庫(kù)佩雷, V.曼庫(kù)索 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司