專利名稱：Tnf結(jié)合肽和tnfr1封閉肽及其在治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別涉及能拮抗腫瘤壞死因子-α (TNF-α)生物學(xué)活性的 TNF結(jié)合肽、TNFRl封閉肽等小分子多肽及TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白。
背景技術(shù)：
TNF-α是一類重要的促炎癥細胞因子，是促炎細胞因子瀑布反應(yīng)中的起始因子， 可促進一系列促炎細胞因子(如IL-l、IL-6、IL-8等)的釋放。臨床研究證實在多種感染或非感染性炎癥及其并發(fā)癥(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病、內(nèi)毒素休克、急性肝壞死、 Crohn' s病等)的發(fā)生和發(fā)展中，全身或炎癥局部TNF-a產(chǎn)生增加起著關(guān)鍵作用；體內(nèi) TNF-α水平過高，往往預(yù)示病人預(yù)后不良。在動物實驗中，單一應(yīng)用大劑量TNF-α即可直接導(dǎo)致內(nèi)毒素樣休克，而用抗TNF抗體則可減輕及阻止內(nèi)毒素性休克的發(fā)生。轉(zhuǎn)TNF-α基因小鼠易患慢性關(guān)節(jié)炎；最近報道給大鼠輸入TNF-α可誘導(dǎo)胰島素抵抗，此為II型糖尿病發(fā)生的重要機制。(Williams R0, Methods Molecular Biology, 2006, 361 265-284 ；Yano Y 等，Diabetes Care, 2004, 27 (3) :844_845。)與TNF發(fā)病相關(guān)的疾病的發(fā)病率在國內(nèi)外呈大幅度上升的趨勢。例如，全球II型糖尿病患者總?cè)藬?shù)已超過1. 5億人，預(yù)計到2025年將達到3億人；在我國大城市中，20歲以上人群的II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)發(fā)病率達到10%，另有10%為糖調(diào)節(jié)異常，即每5個成年人中就有一個糖代謝異常。在我國，目前已有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者400 萬以上，患病率達總?cè)丝诘?.32-0. 34%，Crohn' s病(人群潰瘍性結(jié)腸炎)、銀屑病、強直性脊柱炎以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的與TNF發(fā)病相關(guān)的疾病的發(fā)病率在我國正在逐年上升。由于TNF-α在多種疾病中有重要的致病作用，因此，以TNF-α或TNF受體為靶點設(shè)計藥物，有效阻斷上述病理過程，治療TNF相關(guān)疾病，成為國際藥學(xué)界研究開發(fā)的熱點(Steed Paul M 等，Science，2003，301，1895 1898 ；Scott D. L.等，The New England Journal of Medicine, 2006, 355 :704-712)。目前，國際上已獲 FDA 和 EMEA (European Medicines Evaluation Agency)正式批準，在美國和歐洲已進入臨床試用階段的抗TNF-α 試劑主要有抗TNF抗體鼠人嵌合單克隆抗體(IgGl)，商品名為infliXimab、cA2、Remicade 或 Centocor，(Centocor, Inc, Malvern, PA, FDA licensed. #1242，8/24/1998)靜脈注射，人源化抗 TNF 抗體 adalimumab (商業(yè)名Humira，CDP571 License 12/2002)，全人源化抗體 (D2E7)也已問世。可溶性TNF受體TNFRl-Fc融合蛋白(Etanerc印t、Enbrel或Immunex) (Immunex Corp, Seattle, WA, License#1132，6/6/2000)。上述商品化的抗TNF- α試劑(抗TNF抗體、可溶性TNF受體)雖然已取得較好的臨床治療作用，但仍然存在一系列問題，如存在潛在的副作用、來源受到限制、生物穩(wěn)定差、價格昂貴等。目前，臨床試驗已發(fā)現(xiàn)上述抗TNF-α試劑(抗TNF抗體、可溶性TNF受體)存在導(dǎo)致紅細胞和血小板減少、結(jié)核感染、上呼吸道、尿路感染、皮疹、發(fā)熱、低/高血壓等副作用，嚴重者有可引發(fā)腫瘤。目前，研究開發(fā)安全性好、毒副作用小、成本低的小分子 TNF-α 拮抗劑已受到人們的關(guān)注。(Steed Paul Μ.等，Science，2003，301，1895 1898 ； Gonzale-Rey E 等，Proc Natl Acad Sci USA，2006，103 (11)4228-4233。)
噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)(phage display techniques, PDT)是九十年代初發(fā)展起來的一項新興技術(shù)(Lowman H. B.等.Annu. Rev. Biophys. Biomol Struct 1997 ；26 401-24)， 是研究蛋白質(zhì)分子之間相互作用的一個有效工具。PDT所得到的肽均是來源于噬菌體肽庫，氨基酸序列分析得到肽的序列，人工合成進行機制研究。隨著肽庫構(gòu)建及篩選技術(shù)的不斷發(fā)展、完善，使其對研究蛋白質(zhì)識別機制、確定抗原決定簇、藥物設(shè)計、疫苗研制等方面提供了全新的思路與先進的手段?，F(xiàn)有的噬菌體隨機肽文庫主要有兩種非限制性肽庫(線性肽庫)和限制性肽庫(例如半胱氨酸環(huán)限制的肽庫、引入α-螺旋等二級結(jié)構(gòu)的突變庫等)。一般研究所選用的噬菌體隨機肽庫都是線性的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面選擇噬菌體12線肽庫，以rhTNFRl為誘餌，從中釣取出一條線性的 12肽，該肽可與TNFRl結(jié)合，競爭性抑制TNF- α與TNFRl的結(jié)合，從而拮抗TNF- α的生物學(xué)效應(yīng)，我們將此肽命名為“TNFR1封閉肽”。但人工合成短肽的成本昂貴，且短肽在人體內(nèi)的半衰期較短，從而制約其臨床應(yīng)用。為了克服這些缺陷，本發(fā)明又在此工作的基礎(chǔ)上，構(gòu)建TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白表達載體PIG/3C-TNFR1BP，并借助可高表達外源蛋白的真核細胞C0S7成功表達TNFRlBP/hFc融合蛋白。體外實驗證實這種融合蛋白也能有效地競爭性抑制TNF-α與TNFRl結(jié)合，從而發(fā)揮拮抗TNF-α生物學(xué)活性的作用；體內(nèi)實驗也證實這種融合蛋白能預(yù)防和治療高脂高糖誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗大鼠模型。另一方面，由于與線肽庫相比噬菌體隨機環(huán)肽庫具有以下優(yōu)點(1)由于環(huán)肽固定了兩個半胱氨酸殘基，附加二硫鍵的限制可以幫助維持肽的折疊結(jié)構(gòu)。因此，環(huán)肽庫比線性肽庫更可能篩選到高親和力、高特異性的肽。因為它經(jīng)歷了構(gòu)象的選擇，使之盡可能與靶分子表面和內(nèi)部結(jié)合。(2)環(huán)肽由于其構(gòu)象的復(fù)雜性，故其降解速度較線肽慢，使之半壽期明顯延長。(3)由于受到轉(zhuǎn)化效率的影響，噬菌體肽庫不可能達到完全的隨機化，各種肽庫的多樣性就存在差異。因此，本發(fā)明又選擇噬菌體C7C環(huán)肽庫，分別以rhTNF-α和rhTNFRl 為誘餌，從該環(huán)肽庫中篩選TNF結(jié)合肽和TNFRl封閉肽。通過體外實驗證實這兩種環(huán)肽能抑制TNF-α介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)；體內(nèi)實驗證實這兩種環(huán)肽抑制三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎。本發(fā)明的目的在于提供一種TNFRl封閉肽(線12肽)和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白。本發(fā)明的目的還在于提供編碼所述TNFRl封閉肽和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白的核酸分子。本發(fā)明目的還在于提供制備本發(fā)明融合蛋白的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與一條TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)。本發(fā)明的目 的還在于提供上述TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFRl封閉肽(環(huán)9肽) 的核酸分子。本發(fā)明的目的還在于將上述TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)和TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)應(yīng)用于治療潰瘍性結(jié)腸炎；將TNF- α受體1封閉肽用于治療關(guān)節(jié)炎；將TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白用于治療II型糖尿病。本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容如下一、TNFRl封閉肽(12線肽)和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白1.借助噬菌體展示技術(shù)，以hrTNFRl蛋白為誘餌從噬菌體12線肽庫中篩選到可與 TNFRl結(jié)合的含12個氨基酸的線肽(TNFR1封閉肽)；2.體外實驗證實人工合成的該封閉肽可以完全封閉大鼠腹腔巨噬細胞的呼吸爆發(fā)(何亞萍等，中國免疫學(xué)雜志，2003，19 (6) 385-387)；3.體內(nèi)實驗證實該封閉肽可有效減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的局部關(guān)節(jié)腫脹及炎癥細胞的浸潤，并可抑制促炎癥細胞因子的產(chǎn)生，顯示具有較好的治療作用(何亞萍等， 藥學(xué)學(xué)報，2003，38 (12) :889-892)。 4.構(gòu)建TNF封閉肽-IgFc融合蛋白(1)借助DNA合成技術(shù)，構(gòu)建該封閉肽的編碼DNA片段(并含內(nèi)切酶位點)；(2)借助分子克隆技術(shù)將目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表達載體中，構(gòu)建TNFRlI封閉肽-IgFc的重組體，其技術(shù)路線見圖36。(3)將此重組體瞬時轉(zhuǎn)染C0S7細胞使之成功表達TNFRl封閉肽-hFc融合蛋白；利用間接免疫熒光、流式細胞技術(shù)、胞毒抑制實驗證實此融合蛋白可與細胞表面TNFRl結(jié)合， 從而抑制TNF- α的生物學(xué)活性；用RT-PCR及激光共聚焦顯微鏡檢測證實此融合蛋白可明顯抑制TNF誘導(dǎo)的單核細胞NF-KB核轉(zhuǎn)位，從而抑制促炎細胞因子IL-I β mRNA和IL_8mRNA 的轉(zhuǎn)錄。(4)將重組體轉(zhuǎn)染CHO-Kl和BHK-21細胞并建立穩(wěn)定表達的細胞株，對其分泌的肽-IgFc融合蛋白進行純化并檢測其穩(wěn)定性和生物學(xué)效應(yīng)；5.融和蛋白的主要藥效研究，如體外對炎性細胞活化的影響以及體內(nèi)對高脂喂養(yǎng)大鼠引起的II型糖尿病的預(yù)防和治療作用。二、TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)1.采用噬菌體隨機環(huán)9肽庫展示技術(shù)分別以hrTNF-α和hrTNFRl為誘餌進行親和篩選及生物學(xué)效應(yīng)鑒定得到分別能與TNF-α和TNFRl特異性結(jié)合的TNF結(jié)合肽 (環(huán)9肽)與TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)。(尹丙姣等，華中科技大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2005， 34(6)670-677)2.外實驗證實人工合成的TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽能抑制GFP-TNF融合蛋白與細胞膜上TNFRl結(jié)合；非變性聚丙烯凝膠電泳證明TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽之間不互為配體和受體而相互結(jié)合；TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽對TNF- α的細胞毒效應(yīng)均有抑制作用，且隨著劑量的增加而增強，二者聯(lián)用的效果更好；TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽聯(lián)用能有效抑制TNF-α和IFN-Y誘導(dǎo)的單核細胞呼吸爆發(fā)強度，抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-Ιβ、 IL-SmRNA轉(zhuǎn)錄。(尹丙姣等，細胞與分子免疫學(xué)雜，2007,已校對，待發(fā)表)
3.體內(nèi)實驗證實人工合成的TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽聯(lián)用可顯著減輕TNBS誘導(dǎo)大鼠實驗性潰瘍性結(jié)腸炎的病理損傷，改善癥狀，有效抑制大鼠血清和結(jié)腸組織中NO含量以及結(jié)腸組織中MPO活性的活性，抑制大鼠腹腔巨噬細胞中Il- β、IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄和結(jié)腸組織中TNF-α蛋白的表達，對TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有治療作用。(尹丙姣等，免疫學(xué)雜志，2007，已投稿)通過以上所述并結(jié)合后文實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難看出本發(fā)明的特征和優(yōu)
點ο



一、圖1至圖22 TNFRl封閉肽(12線肽)和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白圖ITNFRl封閉肽(12線肽)對TNF- α誘導(dǎo)的大鼠腹腔ΜΦ呼吸爆發(fā)的影響(抑制作用)圖2. TNFRl封閉肽對TNF- α誘導(dǎo)大鼠腹腔ΜΦ IL-I β mRNA的影響圖3. TNFRl封閉肽對TNF- α誘導(dǎo)大鼠腹腔ΜΦ TNF- α mRNA的影響圖4. TNFRl封閉肽對TNF- α誘導(dǎo)大鼠腹腔MONF- κ Βρ65核轉(zhuǎn)位的影響圖5. TNFRl封閉肽對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)病理改變的影響(Χ200)圖6. TNFRl封閉肽對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔ΜΦ IL-I β mRNA的影響圖7. TNFR封閉肽對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔ΜΦTNF- α mRNA的影響圖8.重組表達載體pIG/3C-TNFRBP的酶切鑒定圖譜圖9.融合蛋白TNFRI-hlgGFc的表達濃度與轉(zhuǎn)染時間的關(guān)系圖 10.融合蛋白 TNFRI-IgGFc 的 Western-Blotting 鑒定圖11.間接免疫熒實驗檢測融合蛋白與TNFR的結(jié)合圖12.流式細胞術(shù)檢測TNFR封閉肽-hlgGFc融合蛋白與TNFR的結(jié)合能力圖13.胞毒實驗檢測融合蛋白對TNF-α胞毒效應(yīng)的拮抗作用圖14.融合蛋白對TNF- α誘導(dǎo)人單核細胞IL-1 β mRNA轉(zhuǎn)錄的影響圖15.融合蛋白對TNF-α誘導(dǎo)人單核細胞IL_8mRNA轉(zhuǎn)錄的影響圖16.融合蛋白對TNF- α誘導(dǎo)單核細胞NF- κ B核轉(zhuǎn)位的影響圖17.高脂高糖誘導(dǎo)大鼠肥胖和胰島素抵抗圖18.融合蛋白可抵抗高脂高糖誘導(dǎo)的大鼠肥胖圖19.融合蛋白對肥胖大鼠糖耐量的影響圖20.融合蛋白能提高胰島素的敏感性圖21.融合蛋白抑制TNF-α的產(chǎn)生圖22.融合蛋白促進組織中胰島素刺激的IRS-I酪氨酸磷酸化二、圖23至35 =TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)圖23.不同噬菌體克隆對TNF- α誘導(dǎo)U937細胞毒效應(yīng)的抑制率作用圖24.噬菌體聯(lián)用對TNF- α誘導(dǎo)U937細胞毒效應(yīng)的抑制作用圖25.各噬菌體與靶蛋白結(jié)合的特異性圖26. TNFR封閉噬菌體對TNF- α誘導(dǎo)IL-1 β mRNA水平的抑制作用，圖中1.陰性對照； 2. TNF- α ； 3. TNF- α +pha. X2 ； 4. TNF- α +pha. X4 ；
5. pha. X2 ；6. pha. X4 ； Μ. Marker圖27. TBP和TRBP對GFP-TNF融合蛋白與L929細胞TNF受體結(jié)合的影響，圖中A GFP-TNF B =GFP-TNF+ 無關(guān)肽 C :GFP_TNF+p印· 38+X4圖28. TBP和TRBP的非變性聚丙烯凝膠電泳圖，圖中1 :p印.38 2 :p印.X4 3 pep.38+X4圖29. TBP和TRBP對TNF- α介導(dǎo)的U937細胞毒效應(yīng)抑制作用的劑量反應(yīng)關(guān)系圖30. TBP和TRBP對TNF- α和IFN- γ誘導(dǎo)單核細胞呼吸爆發(fā)的影響圖31. TBP和TRBP對TNF- α誘導(dǎo)Mo的IL-1 β、IL_8mRNA的抑制作用，圖中 1 正常對照2 =TNFa 對照 3 :TNF_a +ρ印· Χ4 ；4:TNF-a +pep. 38 5 :TNF-a +pep. 38+X4圖32.各種治療對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸病理改變的影響圖33.各實驗組大鼠結(jié)腸組織病理改變(IOX)，圖中A.正常對照組；B.模型組；C.無關(guān)肽對照組D.聯(lián)合多肽治療組； E.抗體治療組 F. 5-氨基水楊酸治療組圖34.各種治療對結(jié)腸炎大鼠腹腔ΜΦ中IL-I β和IL_8mRNA水平的影響，圖中1.生理鹽水對照組 2.模型組3.多肽治療組4.無關(guān)肽對照組 5.抗體治療組 6. 5-氨基水楊酸治療組圖35.各種治療對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中TNF-α蛋白表達的影響(40X)， 圖中A.正常對照組； B.模型組；C.無關(guān)肽對照組D.多肽治療組； D.抗體治療組 E. 5-氨基水楊酸治療組三、圖36.借助分子克隆技術(shù)將目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表達載體中，構(gòu)建TNFRlI封閉肽-IgFc重組體的技術(shù)路線圖。
具體實施例方式
一、TNFRl封閉肽(12線肽)和TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白實施例1 TNFRl封閉肽的篩選及其特異性鑒定借助噬菌體展示技術(shù)，以hrTNFRl蛋白為誘餌從噬菌體12線肽庫中篩選到可與 TNFRl結(jié)合的含12個氨基酸的線肽(TNFR1封閉肽)，其具體篩選過程同下述實施例7之 7. 1。實施例2 TNF受體封閉肽(12線肽)對大鼠腹腔巨噬細胞功能的影響以下TNFRl封閉肽(12線肽)粉劑均由由第三軍醫(yī)大學(xué)合成。2. ITNF受體封閉肽對TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腹腔ΜΦ呼吸爆發(fā)的影響采用NBT 法檢測常規(guī)分離大鼠腹腔巨噬細，向3X105/ml大鼠腹腔巨噬細胞加入TNF-a (5ng/ ml) 100 μ 1禾口 /或TNFRl封閉肽(10 μ g/ml) 100 μ 1，每組設(shè)3個復(fù)孔；然后加入100 μ 1/孔 NBT(2mg/ml)，放37°C C02培養(yǎng)箱中45分鐘；再加入70%甲醇溶液100 μ 1/孔，固定5min ； 棄上清，用70%甲醇溶液洗3次；空氣干燥，最后加入120μ/孔2Μ的KOH溶液和140 μ 1/ 孔的DMS0，立即混勻，在波長630nm下測其OD值。結(jié)果如圖1 外源性TNF2 α可明顯增強 ΜΦ的呼吸爆發(fā)，約為對照組的3倍(P <0.05)，而TNF受體封閉肽則能完全阻斷TNF-a誘導(dǎo)的ΜΦ呼吸爆發(fā)，其值幾乎接近于其基礎(chǔ)值，提示該肽可競爭性抑制TNF-α誘導(dǎo)的ΜΦ 呼吸爆發(fā)。2. 2TNFR1封閉肽對大鼠腹腔ΜΦ IL-I β、TNF- α mRNA的影響采用RT-PCR檢測IL-I β mRNA和TNF-α mRNA 常規(guī)分離大鼠腹腔巨噬細，用TRIzolRNA分離試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄按照Boerhinger Marmheim公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。取 2μ 1上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，分別用IL-I β特異性引物(P1-GATAACCTGCTGGTGTGTGA ； P2-CTTGTGAGGTGCTGATGTAC)、TNF-α 特異性引物(P1-GCGGATCATGGTCAGATCATCTTCTCGAA ； P2-CCCAAGCTTCAGGGCAATGATCCCAAAGTA)、β-actin 特異性引(P1-AACGGCTCCGGCATGTGCAA ； P2-CTTCTGACCCATGCCCACCA)進行 PCR 擴增，IL-1 的 PCR 循環(huán)為94 "C 30s, 62 "C lmin, 72°C lmin，26 個循環(huán)，74°C IOmin ；TNF-α 的 PCR 循環(huán)如下-MV 30s, 58°C 30s, 72°C lmin, 28個循環(huán)，74°C lOmin。取5μ 1 PCR產(chǎn)物加入Ιμ 6 X上樣緩沖液混合，在80伏恒壓下進行2%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，在短波紫外燈下觀察結(jié)果并照相。結(jié)果如圖2所示對照組M Φ未見IL-I β PCR產(chǎn)物出現(xiàn)(泳道4)，TNF- α刺激3h后的M Φ可見明顯的IL-1 β cDNA 特異性條帶(泳道2)，而TNF受體封閉肽則可顯著抑制TNF- α誘導(dǎo)的IL-I β mRNA的表達 (泳道3)，因為其PCR產(chǎn)物條帶明顯減弱，通過密度掃描進行相對定量，證實TNFRl封閉肽的抑制率達50%以上，提示TNFRl封閉肽可有效抑制活化的M Φ表達IL-I β mRNA。同時， 結(jié)果還顯示(如圖3)，未受刺激的M Φ不表達TNF- α mRNA (泳道4)，TNF- α可誘導(dǎo)M Φ強表達TNF- α mRNA,因為圖中可見一條強的特異性PCR產(chǎn)物條帶(泳道2)，而用TNFRl封閉肽則可使TNF-α的PCR產(chǎn)物條帶明顯減弱(泳道3)，其抑制率約為50%，提示TNFRl封閉肽可部分阻斷TNF-α的正反饋作用。2. 3TNFR1封閉肽對TNF- α誘導(dǎo)大鼠腹腔MONF- κ Βρ65核轉(zhuǎn)位的影響NF- κ Βρ65 核轉(zhuǎn)位的檢測取用TNFa (5ng/ml)和/或TNFRl封閉肽(10 μ g/ml)刺激Ih后的大鼠腹腔巨噬細胞(1 X 107)，用冷PBS洗滌，12000r/min, lmin離心，收集細胞；加入400 μ 1細胞膜裂解液重懸細胞；冰上腫脹IOmin加入0.5% ΝΡ240至終濃度為0. 1% 0. 125%;振蕩10s， 12000r/min, lmin離心；加入10 μ 1核膜裂解液重懸沉淀物；冰上放置30min，12000r/min, lmin離心，收集上清，按常規(guī)方法做Western blot。免疫染色的抗體為兔抗人IgGNF-κ B Ρ65多克隆抗體和HRP標記的羊抗兔IgG抗體，均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。結(jié)果如圖4所示。未加任何刺激的對照組無條帶出現(xiàn)，提示在正常情況下腹腔巨噬細胞核內(nèi)無 NF- κ Βρ65存在(泳道1)，單獨給予TNF- α刺激Ih后，大量NF- κ Βρ65向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，因為出現(xiàn)明顯的NF-k B特異性條帶(泳道3)；用TNFRl封閉肽后，則使TNF-α誘導(dǎo)的NF-κΒ 條帶明顯減弱(泳道2)，提示TNFRl封閉肽能部分抑制TNF- α誘導(dǎo)的NF- κ Βρ65核轉(zhuǎn)位。實施例3 TNFRl封閉肽對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響3. 1大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的建立Wistar大鼠， $，體重150 200g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。弗氏完全佐劑。實驗分組對照組注射生理鹽水0.1ml/ 只；模型組在大鼠右足墊部皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(F5881，購自美國Sigma公司)0. Iml/ 只；治療1組注射佐劑后，立即注射TNFRl封閉肽0. Iml/只，劑量分別為0. 5和1. Omg/kg 體重，qd，每個劑量4只，連續(xù)治療10d，治療2組方法與劑量同治療組1，連續(xù)治療20d后用游標卡尺測量大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度(cm)并取關(guān)節(jié)組織按常規(guī)做組織切片，HE染色。注射佐劑后，大鼠煩躁不安，右腳不敢著地行走，18h后出現(xiàn)右后肢踝關(guān)節(jié)明顯紅腫，走路緩慢，進食減少等臨床表現(xiàn)；d3右后肢踝關(guān)節(jié)腫脹減輕，但d8紅腫再度加重(表1)；在接種10 18d后，形成多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為未注射佐劑一側(cè)(左后肢)的踝關(guān)節(jié)輕度紅腫(結(jié)果未顯示)，與人類RA的發(fā)病過程極為相似。而注射TNF受體封閉肽后數(shù)天，大鼠情緒穩(wěn)定，行走基本自如，踝關(guān)節(jié)腫脹有所減輕等。病理切片顯示，大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的踝關(guān)節(jié)滑膜組織中有大量的炎性細胞、漿細胞的浸潤，血管翳形成并伸向關(guān)節(jié)表面，關(guān)節(jié)腔腔隙縮小，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生破壞(如圖5)。說明大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型建立成功。3. 2TNF受體封閉肽對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腫脹的影響用游標卡尺測量大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度(cm)。結(jié)果(表1)顯示大鼠踝關(guān)節(jié)注射佐劑后18h明顯腫脹，但d3則有所減輕，dlO腫脹再度明顯，此后腫脹程度隨時間延長而加重；用TNF受體封閉肽(lmg/kg體重) 后，前3d無明顯療效，但IOd后，治療組踝關(guān)節(jié)腫脹基本消退，與未注射佐劑對照組相似。所用兩種藥物劑量組之間的療效無顯著性差異。3. 3TNF受體封閉肽對佐劑性關(guān)節(jié)炎病理變化的影響按常規(guī)做組織切片，HE染色。 結(jié)果顯示經(jīng)每日lmg/kg體重的TNF受體封閉肽持續(xù)治療20d后，與未用藥的佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠相比，其踝關(guān)節(jié)滑膜細胞層增生程度減小，滑膜組織充血、水腫好轉(zhuǎn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性細胞浸潤明顯減少以及關(guān)節(jié)軟骨破壞程度減輕等。但與正常大鼠的踝關(guān)節(jié)切片相比，治療組尚未完全恢復(fù)正常(如圖5)。表1. TNFRl封閉肽對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響
權(quán)利要求
1.一種 TNF 結(jié)合肽(環(huán) 9 肽)，其氨基酸序列為 Cys-Lys-His-Gln-Trp-His-Iys-His-CyS。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)的核酸分子，包含其簡并的核酸序列。
3.一種 TNFRl 封閉肽(環(huán) 9 肽)，其氨基酸序列為 Cys-Iys-His-Ala-Leu-His-Arg-His-Cys。
4.一種編碼權(quán)利要求3所述的TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)的核酸分子，包含其簡并的核酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的TNF結(jié)合肽或/和權(quán)利要求3所述的TNFRl封閉肽在制備用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一條TNF結(jié)合環(huán)肽和一條TNFR1封閉環(huán)肽，其氨基酸序列分別為Cys-Lys-His-Gln-Trp-His-lys-His-Cys；Cys-lys-His-Ala-Leu-His-Arg-His-Cys，其在體內(nèi)外均能競爭性抑制TNF-α與TNFR1結(jié)合，從而拮抗TNF-α的生物學(xué)功能，并在TNBS誘導(dǎo)的實驗性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型中取得較好的療效。
文檔編號A61P1/04GK102321155SQ201110218429
公開日2012年1月18日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者何亞萍, 尹丙姣, 李卓婭, 梁慧芳, 王晶, 黃麗霞 申請人:華中科技大學(xué)