專利名稱：Btg2在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用的制作方法
BTG2在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因藥物領(lǐng)域，具體涉及BTG2基因(B細胞遷移基因幻在制備抑制癌 癥轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一。據(jù)美國癌癥學會2010年最新統(tǒng)計 數(shù)據(jù)，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤第一位，死亡率居女性惡性腫瘤第二位。在我國，乳腺 癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，近10年來，我國乳腺癌發(fā)病率增加了 47%。與歐美國家 相比較，中國乳腺癌病人的年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢。按我國12億人口計算，每年將新發(fā)現(xiàn) 211，000例乳腺癌。乳腺癌治療最終失敗并導(dǎo)致患者死亡的主要原因是遠處轉(zhuǎn)移。
因此，需要研發(fā)出一種抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物。
現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于BTG2基因的報道，主要集中在其抑制腫瘤增長方面的應(yīng)用， 例如馬曉明、倪克樑等利用RT-PCR法研究31例人胰腺癌及同例癌旁組織BTG2mRNA的 表達，利用免疫沉淀法檢測其BTG2蛋白的表達，用pcDNA3. 1-BTG2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胰腺癌 細胞株swl990，用MTT法測定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后swl990/pcDNA3. 1-BTG2細胞生長曲線；應(yīng)用 AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑，用流式細胞儀測定swl990/pcDNA3. 1-BTG2細胞凋亡的情 況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BTG2基因在人胰腺癌中的表達下調(diào)可能與其惡性行為有關(guān)；BTG2基因的過度 表達可通過誘導(dǎo)凋亡而抑制人胰腺癌細胞株swl990的生長(參見馬曉明、倪克樑.世界 腫瘤雜志· 20-24)。
然而BTG2基因在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物的應(yīng)用國內(nèi)外至今未見報道。 發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種BTG2基因的新應(yīng)用，即BTG2基因在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥 物中的應(yīng)用。
為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是BTG2基因在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物 中的應(yīng)用，具體的，脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達質(zhì)粒PCDNA3-BTG2在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物中 的應(yīng)用。
本發(fā)明同時要求保護一種抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物，所述抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物的活性成分 包括攜帶BTG2基因的真核表達質(zhì)粒。
上述技術(shù)方案中，所述攜帶BTG2基因的真核表達質(zhì)粒為真核表達質(zhì)粒 pcDNA3-BTG2。
上述技術(shù)方案中，真核表達質(zhì)粒PCDNA3-BTG2的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，可以參見 文獻張林、侯艷紅、王孟薇、吳本儼、李楠.中華腫瘤防治雜志.200815 (16)。
上述技術(shù)方案中，所述癌癥包括但不限于乳腺癌。
由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點
本發(fā)明將脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達質(zhì)粒pcDNA3-BTG2導(dǎo)入腫瘤細胞，使BTG2基因在3腫瘤細胞中表達，然后BTG2基因通過抑制腫瘤細胞周期進程和影響細胞周期進程和細胞 轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達，抑制了腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移能力。


圖1為實施例一中轉(zhuǎn)染BTG2質(zhì)粒后MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞BTG^nRNA表 達情況；
圖2為實施例一中轉(zhuǎn)染BTG2質(zhì)粒后MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞BTG2蛋白表 達水平；
圖3為實施例一中BTG2基因抑制MCF-7細胞遷移；
圖4實施例一中BTG2基因抑制MDA-MB-231細胞遷移；
圖5為實施例一中BTG2基因抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)移；
圖6為實施例一中SuperArray轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片(0HS-028)中含有的基因；
圖7為實施例一中轉(zhuǎn)染BTG2基因后MDA-MB-231細胞SuperArray結(jié)果；
圖8為實施例一中BTG2轉(zhuǎn)染MDA_MB_231細胞肺克隆實驗典型圖9為實施例一中裸鼠正常肺臟和肺轉(zhuǎn)移病理(HE，X 200)；其中，A裸鼠正常肺 臟病理，B裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶病理。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述
實施例一
材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231及MCF-7購于美國細胞收藏中心(ATCC)，并 由本實驗室保存和培養(yǎng)；D-MEM培養(yǎng)基干粉，小牛血清，胰酶粉末購自Gibco公司；標準蛋 白質(zhì)分子量、SDS-PAGE上樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液、TE電泳緩沖液、IOX轉(zhuǎn)膜液、30% Acry-Bis、Tris-Hcl、過硫酸銨(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)購自江蘇 碧云天生物技術(shù)研究所；二甲基亞砜(DMS0)、瓊脂糖和Tween-20來自上海高科技生物工程 有限公司；抗BTG2、cyclin Bi、cyclin Dl等抗體購自美國Santa Cruzs生物技術(shù)公司。 RNase A 和 10g/mL proteinase K 購自美國 Sigma Aldrich 公司。
1)細胞培養(yǎng)MDA-MB_231及MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100 萬U/L青霉素和鏈霉素的D-EME培養(yǎng)基。細胞置于5% CO2, 37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2_3天 傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。
2)細胞的轉(zhuǎn)染和克隆篩選轉(zhuǎn)染前一天，將細胞用胰酶消化、計數(shù)，以合適的密度 接種6孔板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使轉(zhuǎn)染當日細胞融合度為70% 90%。在鋪板 和轉(zhuǎn)染期間避免使用抗生素。轉(zhuǎn)染溶液配制質(zhì)粒LipOfectamine2000用量比為1 μ g/ 孔2. 5 μ 1/孔。2 μ g/孔DNA加入100 μ 1/孔DMEM混勻，室溫靜置5min，備用；5 μ 1/孔 Lipofectamine2000加入100 μ 1/孔基礎(chǔ)DMEM混勻，室溫靜置5min，備用；將稀釋的DNA同 稀釋的脂質(zhì)體試劑混合，在室溫保溫30min后，加入800 μ 1/孔基礎(chǔ)DMEM，備用。用PBS及 無抗生素的基礎(chǔ)DMEM洗滌細胞，每孔加入Iml轉(zhuǎn)染混合液，5% C02，37°C培養(yǎng)證。證后，棄 去含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)后，72小時內(nèi)完成實驗即為瞬時 轉(zhuǎn)染；如果細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 后，更換含G418的培養(yǎng)基，大約兩周后，篩選陽性穩(wěn)定克隆，即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將前述所構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pCDNA3-BTG2分別轉(zhuǎn)染到 人類乳腺癌MCF-7細胞、MDA-MB-231細胞，同時轉(zhuǎn)染“空”的pcDNA3質(zhì)粒作為陽性對照。 MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染BTG2基因后的RT-PCR電泳圖見圖1。從圖中可以看 出，MCF-7/BTG2細胞和MDA-MB-231/BTG2細胞中BTG2mRNA明顯高表達，而相應(yīng)的母細胞和 空質(zhì)粒細胞中BTG2mRNA均為極低表達。MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染BTG2基因后 的Western blot電泳圖見圖2。從圖中可以看出，MCF-7/BTG2和MDA-MB-231/BTG2細胞中 的BTG2蛋白表達水平明顯高于相應(yīng)的母細胞和轉(zhuǎn)染“空”質(zhì)粒的細胞，同時，母細胞和轉(zhuǎn)染 “空”質(zhì)粒的細胞BTG2蛋白表達水平相同。
以上結(jié)果從RNA水平和蛋白水平均證明，BTG2基因已經(jīng)轉(zhuǎn)染進入乳腺癌細胞 MCF-7和MDA-MB-231細胞，并且可以使乳腺癌細胞高表達BTG2蛋白，同時“空”的pcDNA3 質(zhì)粒沒有影響B(tài)TG2蛋白表達。
上述flfestern-blot法方法的主要過程為收集細胞并轉(zhuǎn)至于1. 5ml的Eppendorf 管中離心O500轉(zhuǎn)/分)5分鐘，棄上清，并加入ΙΟΟμ 1 IP裂解液，置于冰上2小時。4。C 離心5分鐘(2，500轉(zhuǎn)/分鐘)，轉(zhuǎn)移上清液至新的Eppendorf管，并采用分光光度計檢測樣 品蛋白含量。加入蛋白上樣緩沖液(5Χ)混勻，置于恒溫混勻器上，100°C 5分鐘，蛋白電泳 后轉(zhuǎn)至醋酸纖維膜上。膜采用封閉液(5%脫脂奶粉，IXT-BST緩沖液)封閉lh。洗滌，并 分別加入一抗β-Actin，BTG2，Cyclin Bi, Cyclin D1，經(jīng)封閉液處理的醋酸纖維膜室溫撫 育1小時。T-BST緩沖液洗膜3次，加入二抗(1 1000稀釋)撫育1小時。T-BST緩沖液 洗膜3次，最后加ECL發(fā)光劑，顯影、定影，膠片洗滌和干燥后，掃描分析。
3)體外劃痕實驗采用體外劃痕方法測定細胞遷移能力。取對數(shù)生長期細胞，按 IXlO6Ail接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細胞完全飽和。用無菌2001的Tip頭垂直劃出一無 細胞的細痕，制作培養(yǎng)細胞傷口模型，并用無菌IXPBS小心清洗三次去除漂浮細胞(此時 作為劃痕后0時刻)。每板接種三種細胞，每種細胞設(shè)2個復(fù)孔。最后分別繼續(xù)培養(yǎng)M小 時和48小時，在顯微鏡下觀察劃痕寬度，并采用數(shù)碼照相機拍照。
應(yīng)用體外細胞劃痕實驗方法檢測BTG2基因?qū)θ橄侔┘毎w外遷移能力的影響。 圖3為轉(zhuǎn)染BTG2基因后MCF-7細胞的劃痕實驗結(jié)果，從圖中可以看出，隨時間延長，細胞向 劃痕區(qū)域浸潤擴散，MCF-7/BTG2細胞較MCF-7和MCF-7/Neo細胞浸潤慢，在劃痕后48小時， MCF-7/BTG2細胞劃痕間隙明顯大于MCF-7細胞和MCF-7/Neo細胞，而MCF-7細胞和MCF-7/ Neo細胞之間差異不明顯。
圖4為轉(zhuǎn)染BTG2基因后MDA-MB-231細胞的劃痕實驗結(jié)果，與MCF-7細胞類似， 在劃痕后48小時，MDA-MB-231和MDA-MB-231/Neo細胞已經(jīng)浸潤擴散覆蓋了劃痕間隙，而 MDA-MB-231/BTG2細胞仍可看到明顯的劃痕間隙。
以上實驗結(jié)果說明BTG2基因表達水平的提高可以抑制或降低乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231的遷移能力，同時也說明“空”pcDNA 3質(zhì)粒對乳腺癌細胞的遷移能力沒有明顯影響。
4) Boyden 小室實驗
采用Boyden小室法測定細胞轉(zhuǎn)移能力。在Boyden下室加入含20%的新生牛血清 的DMEM培養(yǎng)基，采用8 μ m人工基底膜將兩室隔開。加40 μ 1不含血清的DMEM培養(yǎng)基制備5的單細胞懸液(IXlO6Ail)接種到Boyden上室中。細胞置于37 °C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)8 小時。小心將基底膜取出，甲醇固定，并采用Giemsa染色，用棉簽將未穿過膜的細胞小心擦 去，然后在顯微鏡下觀察并拍照。
應(yīng)用體外Boyden小室實驗方法研究BTG2基因?qū)θ橄侔┘毎鸐CF-7和MDA_MB_231 轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果如圖5所示，使用8μπι人工基底膜，8小時之后，MDA-MB-231和 MDA-MB-231/Neo均有大量細胞穿過基底膜，而MDA-MB-231/BTG2細胞僅有少量細胞穿過基 底膜。MCF-7細胞也有同樣的結(jié)果。通過在顯微鏡(100倍)下計數(shù)每視野穿過基底膜的 細胞數(shù)目，每組細胞計數(shù)6個視野，應(yīng)用SAS8. O統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)進行方差分析。結(jié)果發(fā) 現(xiàn):MDA-MB-231 與 MDA-MB-231/Neo 之間 ρ = 0. 2123，差異無統(tǒng)計學意義，MDA-MB-231 與 MDA-MB-231 /BTG2、MDA-MB-231 /Neo 與 MDA-MB-231 /BTG2 之間，ρ 值均 < O· 01，細胞數(shù)具有明 顯差異。MCF-7與MCF-7/Neo之間ρ = 0. 0892，差異無統(tǒng)計學意義，MCF-7與MCF-7/BTG2、 MCF-7/Neo與MCF-7/BTG2之間，ρ值均< 0. 01，細胞數(shù)具有明顯差異。以上結(jié)果說明，BTG2 基因表達增加可以抑制了乳腺癌細胞MCF-7，MDA-MB-231的轉(zhuǎn)移能力。
5) SuperArray功能分類基因芯片實驗應(yīng)用美國SABiosciences公司的 SuperArray 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片(0HS-028)，對 MDA-MB-231/Neo 和 MDA-MB-231/BTG2 細胞分 別進行檢測，具體方法如下
首先提取待測細胞的總RNA(具體方法同RT-PCR)；提取總RNA后進行測量總RNA 溶解于 RNase-free water, A260 > llng/ul, A260/A280 > 2. 0，A260/A230 > 1. 7 ；進行變 性瓊脂糖電泳(看RNA的完整性，18S和28S條帶)；應(yīng)用"TrueLabeling_AMP2. O試劑盒進行 cRNA合成與放大，具體步驟參照試劑盒說明進行。純化后、Biotin標記的cRNA即可用于上 含基因芯片的膜雜交含基因芯片的每個雜交管中加入Iml的雜交緩沖液，然后加入20 μ g 的biotin標記的cRNA，上雜交爐60°C，15 20轉(zhuǎn)/min，過夜。按說明將經(jīng)過雜交的基因 芯片膜洗滌后，應(yīng)用CDP-Mar化學發(fā)光試劑盒進行反應(yīng)顯色。對反應(yīng)后的基因芯片膜應(yīng)用 Kodak X光片進行曝光、顯影后，得到superarray圖像，然后根據(jù)相應(yīng)基因位點對圖像進行 分析。
結(jié)果如圖6所示，0HS-028轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片上含有與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的113個基 因。經(jīng)過分析，有7個基因有較明顯差異，結(jié)果如圖7所示，分別為SET、NMEU NME2、RBI、 RH0C、PLAUR和P53。其中，BTG2基因?qū)е律险{(diào)的是SET、NMEl、NME2、RBl和P53基因，導(dǎo)致 下調(diào)的是RHOC和PLAUR。
SET、RB和P53基因與調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡有關(guān)，BTG2基因引起這些基因上調(diào)，說明 BTG2對細胞周期和凋亡的作用可能與上調(diào)這些基因表達，影響了相關(guān)的信號通路有關(guān)。
NMEU NME2、RHOC和PLAUR這些基因與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，BTG2基因引起 這些基因的上調(diào)和下調(diào)，說明BTG2基因?qū)δ[瘤細胞轉(zhuǎn)移的抑制可能與這些基因相關(guān)的信 號通路有關(guān)。
6)乳腺癌轉(zhuǎn)移模型建立取對數(shù)生長期MDA-MB-231/Neo細胞、MDA-MB-231/BTG2 細胞，經(jīng)0. 25%胰蛋白酶消化，離心去上清，而后用基礎(chǔ)培養(yǎng)液離心洗滌2次，計數(shù)細胞數(shù)， 調(diào)整細胞濃度為IX IO6個/mL，將細胞重懸于無菌PBS溶液。取前述裸鼠12只，每種細胞 種6只，將裸鼠放入固定器中，在嚴格無菌條件下經(jīng)尾靜脈注入細胞懸液0. 2mL·裸鼠腫瘤 接種后，連續(xù)置恒溫(25°C ±2°C)、恒濕(45% 50%)、無菌凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，定期觀察裸鼠精神、飲食和排便。裸鼠飼養(yǎng)4周脫頸處死，解剖，取出雙肺。Bouin氏液固定雙肺， 放大鏡下觀察、計數(shù)肺結(jié)節(jié)。最后常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡觀察。
結(jié)果顯示MDA-MB-231/Neo細胞組6只均有肺轉(zhuǎn)移，MDA-MB-231/BTG2組僅發(fā)現(xiàn)3 只有肺轉(zhuǎn)移。肉眼觀典型的肺轉(zhuǎn)移為兩肺分布多個大小不等的粟粒狀淺黃色結(jié)節(jié)，以下肺 多見。結(jié)果見表2和圖8和9。
表2MDA-MB-231細胞肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果
權(quán)利要求
1.BTG2基因在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
2.脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達質(zhì)粒pcDNA3-BTG2在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物中的用。
3.一種抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物，其特征在于，所述抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物的活性成分包括攜帶 BTG2基因的真核表達質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物，其特征在于，所述攜帶BTG2基因的真核表 達質(zhì)粒為真核表達質(zhì)粒pcDNA3-BTG2。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因藥物領(lǐng)域，具體涉及BTG2基因(B細胞遷移基因2)在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核表達質(zhì)粒pcDNA3-BTG2導(dǎo)入腫瘤細胞，使BTG2基因在腫瘤細胞中表達，然后BTG2基因通過抑制腫瘤細胞周期進程和影響細胞周期進程和細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達，抑制了腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移能力。
文檔編號A61K48/00GK102028956SQ20101058573
公開日2011年4月27日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者樊賽軍, 胡旭東 申請人:蘇州大學