專利名稱：使用滑膜衍生的組織或細(xì)胞治療及修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損或損傷的組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及軟骨缺損或損傷(本文中可互換使用)的治療和修復(fù)。本發(fā)明的組合物包括基質(zhì)和滑膜組織或細(xì)胞用于填充軟骨缺損。也可以使用形成層細(xì)胞?；|(zhì)和滑膜組織或細(xì)胞制品還可含有增殖劑和/或轉(zhuǎn)化因子以分別促進(jìn)滑膜細(xì)胞的擴(kuò)增和滑膜細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化，引發(fā)軟骨組織的形成。本發(fā)明的組合物還包括滑膜或形成層細(xì)胞，該細(xì)胞已用生軟骨基因(chondrogenic gene)轉(zhuǎn)染，使得該細(xì)胞可以表達(dá)軟骨發(fā)生因子，而該因子能夠促進(jìn)軟骨形成。本發(fā)明方法包括從對關(guān)節(jié)囊滑膜的最小侵入性活檢中獲得滑膜組織或細(xì)胞，向滑膜組織或細(xì)胞中加入適當(dāng)?shù)脑鲋澈?或轉(zhuǎn)化因子，并與結(jié)構(gòu)基質(zhì)一起或不加結(jié)構(gòu)基質(zhì)，將組織(膜片或碎塊)或細(xì)胞置于缺損的部位。或者，可以用層疊的滑膜膜片填充缺損部位?；そM織可以在填充到缺損處之前被部分地失活(devitalized)?；蛘撸捎煤熊浌羌?xì)胞的基質(zhì)填充缺損部位，所述軟骨細(xì)胞是在體外或原位從滑膜細(xì)胞或形成層細(xì)胞制備得到?；蛘撸捎皿w外或原位形成的、部分轉(zhuǎn)化的滑膜衍生組織填充缺損處。然后用覆蓋膜覆蓋被填充的缺損部位，優(yōu)選該覆蓋膜含有部分失活的滑膜片。本發(fā)明方法可特別用于治療骨關(guān)節(jié)炎和其它導(dǎo)致軟骨損傷的疾病及創(chuàng)傷中的關(guān)節(jié)軟骨缺損。
將美國專利No.5,206,023，5,270,300和5,853,746引入本申請作為參考。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)是骨骼中各塊骨相連接的一種普遍方式。正常關(guān)節(jié)聯(lián)接的骨末端覆蓋有關(guān)節(jié)軟骨組織，軟骨組織可以保證骨彼此之間幾乎無摩擦的運(yùn)動[L.Weiss編，Cell and Tissue Biology(MunchenUrban andSchwarzenburg，1988)247頁]。
關(guān)節(jié)軟骨的特征在于特殊的結(jié)構(gòu)組成。其由包埋在細(xì)胞間物質(zhì)(通常在文獻(xiàn)中稱為“軟骨基質(zhì)”)中的特別細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)構(gòu)成，這種胞間物質(zhì)富含蛋白聚糖、以II型為主的膠原纖維、其它蛋白和水[Buckwalter等，“Articular CartilageInjury and Repair，”Injury andRepair of the Musculoskeletal Soft Tissues(Park Ridge，III.American Academy of Orthopaedic Surgeons Symposium，1987)，465頁]。該軟骨基質(zhì)由包埋其中的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生并維持。軟骨組織既無神經(jīng)分布支配，也沒有血管或淋巴系統(tǒng)穿入。但是，在成人的成熟關(guān)節(jié)中，在下面的軟骨下骨組織在骨組織和軟骨之間形成了一層連續(xù)的薄板。該軟骨下骨組織或骨板受神經(jīng)支配，并具有血管。這層骨板之下，骨組織形成了含有骨髓的骨小梁。在未成熟的關(guān)節(jié)中，關(guān)節(jié)軟骨之下即為初級骨小梁。關(guān)節(jié)中的半月板組織的一部分也由軟骨構(gòu)成，其構(gòu)成與關(guān)節(jié)軟骨類似[Beaupre，A.等，Clin.Orthop.Rel.Res.，72-76頁(1986)]。
在關(guān)節(jié)表面中已發(fā)現(xiàn)了兩種缺損類型，為全層缺損(full-thicknessdefects)和表淺缺損。全層缺損是穿入或穿通軟骨下骨板的缺損；表淺缺損則不是。這些缺損的區(qū)別不僅在于軟骨的物理損傷程度，而且還在于每種損傷所引發(fā)的修復(fù)反應(yīng)的性質(zhì)。
關(guān)節(jié)表面的全層缺損包括對透明軟骨，鈣化軟骨層和帶有其血管和骨髓的軟骨下骨組織的損傷。全層缺損會引發(fā)劇烈疼痛，因?yàn)楣前逯泻懈杏X神經(jīng)末稍。這種缺損通常由嚴(yán)重的創(chuàng)傷而導(dǎo)致或在退行性關(guān)節(jié)疾病如骨關(guān)節(jié)炎的晚期發(fā)生。全層缺損有時會導(dǎo)致出血，并誘發(fā)軟骨下骨的修復(fù)反應(yīng)[Buckwalter等，“Articular CartilageComposition，Structure，Response to Injury，and Methods ofFacilitating Repair”，Articular Cartilage and Knee Joint FunctionBasic Science and Arthroscopy(New YorkRaven Press，1990)19-56頁]。形成的修復(fù)組織是具有血管的纖維型軟骨，其生物機(jī)械性能較差，并且不長期持續(xù)存在[Buckwalter等，(1990)，同上]。
關(guān)節(jié)軟骨組織的表淺缺損僅限于軟骨組織本身。這種缺損通常不會愈合，也不表現(xiàn)出修復(fù)反應(yīng)傾向，因而很難治。
表淺缺損可能在軟骨表面上以裂隙，刮傷或裂口出現(xiàn)，或者在患病組織中表現(xiàn)出“蟹肉”(crab-meat)外觀。表淺缺損沒有全層缺損中會出現(xiàn)的出血血管(血斑點(diǎn))。表淺缺損可能沒有明確的病因，但是通常是導(dǎo)致軟骨組織磨損的機(jī)械損傷的結(jié)果。關(guān)節(jié)創(chuàng)傷可能導(dǎo)致機(jī)械損傷，如撕裂的半月板組織移位入關(guān)節(jié)，半月板切除術(shù)，撕裂的韌帶導(dǎo)致的關(guān)節(jié)松弛，關(guān)節(jié)錯位，骨折或遺傳性疾病。表淺缺損還是早期退行性關(guān)節(jié)疾病(如骨關(guān)節(jié)炎)的特征。由于軟骨組織不受神經(jīng)支配[Ham’s Histology(9thed.)(PhiladelphiaJ.B.Lippincott Co.1987)，266-272頁]，也沒有血管，所以通常表淺缺損不產(chǎn)生疼痛感。盡管無痛，但是表淺缺損通常不會愈合，并經(jīng)常退變?yōu)槿珜尤睋p。
通常認(rèn)為由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏血運(yùn)，所以受損的軟骨組織不能接受充分或適當(dāng)?shù)拇碳砑ぐl(fā)修復(fù)反應(yīng)[Webber等，“Intrinsic RepairCapabilities of Rabbit Meniscal FibrocartilageA Cell CultureModel”，(30thAnn.Orthop.Res.Soc.，Atlanta，F(xiàn)eb.1984)；Webber等，J.Orthop.Res.，3，36-42頁(1985)]。理論認(rèn)為軟骨組織中的軟骨細(xì)胞在正常情況下，并不接觸足量的修復(fù)刺激物質(zhì)，如生長因子和通常存在于受損的血管化組織中的血纖維蛋白凝塊。
使受損軟骨組織接觸修復(fù)刺激物的一個已經(jīng)投入使用的方法是鉆孔或刮通軟骨到達(dá)軟骨下骨以引起出血[Buckwalter等，(1990)同上]。但不幸的是，組織對這種外科創(chuàng)傷的修復(fù)反應(yīng)通常類似于在引起出血的全層缺損中觀察到的天然發(fā)生的修復(fù)反應(yīng)，即形成纖維型軟骨，其生物機(jī)械性能不足，并且不會長期存在[Buckwalter等(1990)，同上]。
已經(jīng)分離出多種生長因子，目前已用于研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[參見，如Rizzino，A.，Dev.Biol.，130，411-422頁(1998)]。已有報道說這些生長因子中的一些，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，能夠在體外在胚胎大鼠間充質(zhì)細(xì)胞中促進(jìn)軟骨特異性分子的形成，如II型膠原和軟骨特異性蛋白聚糖[如Seyedin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，2267-71頁，(1985)；Seyedin等，J.Biol.Chem.261，5693-95頁，(1986)；Seyedin等，J.Biol.Chem.262，1946-1949頁，(1987)]。
已有上百萬人被診斷患有骨關(guān)節(jié)炎，即在其關(guān)節(jié)軟骨中有退行性缺損或損傷。盡管已有多種方法聲稱可以在受損軟骨中引發(fā)修復(fù)反應(yīng)，但是這些治療都沒有投入實(shí)質(zhì)性的應(yīng)用[Buckwalter等，(1990)同上；Knutson等，J.Bone and Joint Surg.，68-B，795頁(1986)；Knutson等，J.Bone and Joint Surg.，67-B，47頁(1985)；Knutson等，Clin.Orthop.，191，202頁(1984)；Marquet，Clin.Orthop.，146，102頁(1980)]。一般這樣的治療通常只會帶來暫時的緩解?！败浌潜Ｗo(hù)劑”的全身應(yīng)用據(jù)稱會阻止骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展并減輕疼痛[Lohmander. L.S.等，Ann.Rheum.Dis.，55(7)，424-31頁(1996)]。但是，這樣的保護(hù)劑并未顯示出促進(jìn)軟骨組織損傷或缺損修復(fù)的能力。
一種已被考慮的方法在美國專利No 4,846,835中描述。該專利中，通過活組織檢查取出成熟的軟骨組織，從中收集軟骨細(xì)胞，然后在組織培養(yǎng)中生長或擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目，然后將其置于膠原凝膠基質(zhì)中一起植入到缺損部位，所述基質(zhì)用于將軟骨細(xì)胞固定在原位。利用骨膜層使移植的細(xì)胞(即移植物)牢固在缺損處。該方法的缺點(diǎn)是比本發(fā)明侵入性大，并在取出成熟軟骨過程中造成了額外的軟骨缺損。將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用于修復(fù)缺損也有缺點(diǎn)，因?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與滑膜細(xì)胞相比其增殖潛力較為有限。
另外一種方法是轉(zhuǎn)化骨髓衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞，以在體外產(chǎn)生軟骨細(xì)胞，用于植入軟骨缺損[Caplan和Haynesworth，美國專利No.5,811,094 ]。這些細(xì)胞只能通過骨髓活檢獲得，其可能伴有患者供體部位的長期局部病變(通常在骨盆的髂嵴)。然后必須使用復(fù)雜的技術(shù)純化活檢的骨髓細(xì)胞，體外擴(kuò)增并接種于缺損部位[參見Caplan等，Clin.Orthop.342，254-269頁(1997)]。
文獻(xiàn)中另外一種方法是施加電壓穿透缺損處周圍的組織，以刺激新組織的生長[美國專利No.4,506,673]。
美國專利No.5,270,300，5,206,023和5,368,858公開了另外一種修復(fù)這種缺損的方法，其中本發(fā)明人描述了這樣一種發(fā)明將修復(fù)細(xì)胞從滑膜腔隙(synovial compartment)吸入缺損部位，在缺損處誘發(fā)其增殖，并分化為軟骨細(xì)胞，合成新的軟骨基質(zhì)。
已有報道稱將細(xì)胞維持在關(guān)節(jié)軟骨缺損處的懸液或基質(zhì)中的一種方法是將一層合適的覆蓋薄膜縫合在缺損空隙的頂部。目前所用的覆蓋膜材料源自于骨膜，軟骨膜或者是肌肉筋膜。這些覆蓋膜或其它人工覆蓋膜的顯著缺點(diǎn)是該覆蓋膜本身不會轉(zhuǎn)化為軟骨組織，或僅有限程度地發(fā)生轉(zhuǎn)化。這樣，缺損空隙永遠(yuǎn)不會被修復(fù)軟骨完全填充。而且，纖維型覆蓋膜的降解速度極慢。另外，這些覆蓋膜在缺損邊緣處不會與天然的組織整合為一體。這種覆蓋膜組織可含有成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞不會轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，而會導(dǎo)致不期望的疤痕樣組織。這樣，在某些現(xiàn)有技術(shù)的覆蓋膜中，成纖維細(xì)胞可能會遷移出來進(jìn)入修復(fù)空隙，將其污染并形成不期望的疤痕組織。
因此，需要一種簡單，快速并且可靠的方法來治療表淺及全層軟骨缺損，如嚴(yán)重的機(jī)械損傷和骨關(guān)節(jié)炎。
發(fā)明概述本發(fā)明提供有效的治療組合物和方法，引發(fā)人類和其它動物軟骨損傷的修復(fù)作用。本發(fā)明組合物和方法的應(yīng)用還能夠促進(jìn)創(chuàng)傷和多種形式骨關(guān)節(jié)炎的痊愈，所述疾病會引發(fā)有效關(guān)節(jié)功能的喪失，而可能需要切除和用金屬和/或塑料人工關(guān)節(jié)替換患病關(guān)節(jié)。
本發(fā)明中，對患有關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者在關(guān)節(jié)區(qū)域施用局部麻醉，或可采用全身麻醉。使用合適的外科工具取出一部分滑膜組織。優(yōu)選從與缺損相同的關(guān)節(jié)取出滑膜組織，因?yàn)橐扬@示，軟骨和滑膜細(xì)胞成熟形式具備其所源自的特定關(guān)節(jié)的典型機(jī)械和結(jié)構(gòu)特性[Kuettner，K.E.，Clin.Biochem.，25，155-63頁(1992)(cartilage of different jointsdiffer biochemically)；Archer，C.W.，Ann.Rheum.Dis.，53，624-30頁(1994)(fetal cartilage differs joint to joint]。但是有些情況下，可能期望從大關(guān)節(jié)中取出滑膜組織，用于修復(fù)含有不足量供體滑膜組織的小關(guān)節(jié)。這樣獲得的滑膜組織或細(xì)胞可按下文所述用于修復(fù)過程?；蛘?，可以使用取自骨膜或軟骨膜的形成層作為細(xì)胞或修復(fù)組織的來源。
在用修復(fù)材料填充缺損之前，優(yōu)選利用蛋白聚糖-降解酶處理缺損部位的關(guān)節(jié)軟骨邊緣，以除去表面的蛋白聚糖。這種處理會使下面的膠原網(wǎng)絡(luò)暴露，使得修復(fù)材料更好地與組織整合并粘附。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，將滑膜組織用于直接的再植術(shù)。優(yōu)選在轉(zhuǎn)化因子的存在下，再植滑膜或滑膜碎片，所述轉(zhuǎn)化因子能夠誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，該軟骨細(xì)胞依次會形成新的軟骨，從而修復(fù)缺損。優(yōu)選地，將滑膜或滑膜碎片分布在生物可降解基質(zhì)中，然后植于缺損部位。轉(zhuǎn)化因子可以利用控釋運(yùn)送系統(tǒng)給予。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，在手術(shù)室里用膠原酶和胰蛋白酶簡短地消化滑膜碎片(30-45分鐘)，再快速純化。然后將這些滑膜小碎塊(bits)直接移植到缺損部位，懸浮在生物可降解基質(zhì)中，該基質(zhì)中含有轉(zhuǎn)化因子，能夠使其在植入后分化為軟骨細(xì)胞?；蛘呖蓪⒒て懦啥鄬佣询B，再填充到缺損處。加入適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化因子可以促進(jìn)滑膜細(xì)胞在原位轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。優(yōu)選將這種因子置于各滑膜膜片之間。還可使用適當(dāng)?shù)目寡苌蓜?，以防止新的軟骨組織發(fā)生血管化，可使用適當(dāng)?shù)牡V化/鈣化抑制劑來防止新的軟骨組織骨化。
或者，將整個骨膜，軟骨膜，或優(yōu)選骨膜或軟骨膜形成層的膜片，填充到缺損處。以下任何組織構(gòu)型均可小碎塊，膜片，點(diǎn)綴有小碎塊的膜片，懸浮在生物可降解基質(zhì)中的組織，或上述各種相結(jié)合。同樣，可結(jié)合使用各種不同組織。例如，可將骨膜形成層膜片置于缺損處的底部，用含有滑膜或骨膜小碎塊的生物可降解基質(zhì)填充缺損處，再可用滑膜膜片覆蓋缺損處。或者，可將滑膜膜片和骨膜或軟骨膜膜片的混合物填充于缺損處。
滑膜細(xì)胞也可用于移植過程。從滑膜或滑液中制備滑膜細(xì)胞，或從骨膜或軟骨膜的形成層中制備形成層細(xì)胞。如果細(xì)胞的數(shù)目尚不足夠(如下述)，可將細(xì)胞在體外培養(yǎng)并擴(kuò)增。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞已擴(kuò)增到足夠的數(shù)量時，將其植入軟骨缺損部位。優(yōu)選地，將細(xì)胞植入可生物降解的基質(zhì)中，再將基質(zhì)植入缺損部位。在轉(zhuǎn)化因子的存在下植入細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化因子能夠誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，該細(xì)胞接下去可形成新的軟骨，從而修復(fù)缺損。轉(zhuǎn)化因子可以利用控釋運(yùn)送系統(tǒng)給予。
或者，可從轉(zhuǎn)化的滑膜膜片中分離出軟骨細(xì)胞，然后通過將其插入基質(zhì)，或如上所述懸浮于基質(zhì)中，植入到缺損空隙處。以這種方式誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞還可在植入之前在體外擴(kuò)增，以提高其數(shù)量，并選擇軟骨生成亞群。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，在轉(zhuǎn)化因子的存在下，滑膜細(xì)胞在體外被誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，該細(xì)胞開始形成軟骨組織?？蛇M(jìn)行細(xì)胞外周基質(zhì)的部分酶促消化，以釋放單個的軟骨細(xì)胞，然后將其作為一團(tuán)整體植入缺損部位?；蛘?，可將體外形成的軟骨組織植入生物可降解基質(zhì)，然后將該基質(zhì)植入缺損部位。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，滑膜細(xì)胞可在原位轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。在本發(fā)明的這一方面，通過利用浸透分化因子的基質(zhì)墊，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞在原位分化，該基質(zhì)墊在一處滑膜隱窩或臨近脂肪墊處與滑膜縫合?；蛘撸部蓪⒔阜只蜃拥幕|(zhì)墊與滑膜組織就在緊靠關(guān)節(jié)間隙之外直接相連，而無需打開關(guān)節(jié)。切出轉(zhuǎn)化的組織，并使用膠原酶和胰蛋白酶消化約30-45分鐘，快速分離細(xì)胞。在原位植入以前，新轉(zhuǎn)化的細(xì)胞還可進(jìn)一步在體外擴(kuò)增和/或分化。然后可將軟骨細(xì)胞植入缺損部位，或懸浮其中(由覆蓋膜覆蓋，以防止細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)腔)，或在基質(zhì)中，以使細(xì)胞保持在缺損間隙。覆蓋膜可在損傷頂部周邊附近與缺損邊緣縫合在一起。
在前述的每一具體實(shí)施方式
中，優(yōu)選將組織容納在生物可降解基質(zhì)中進(jìn)行移植，以防止組織或細(xì)胞從缺損部位丟失，有效地填充缺損間隙，并作為所用于治療缺損的任何藥劑或因子的載體?；蛘?，或額外地，優(yōu)選移植后，用薄的生物可降解膜(“覆蓋膜”)覆蓋缺損部位的表面，以防止組織或細(xì)胞從缺損部位丟失。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，可使用滑膜覆蓋膜，優(yōu)選部分失活的(即，部分消除了巨噬細(xì)胞的)或完全天然的滑膜覆蓋膜，覆蓋填充的缺損處。或者，可使用筋膜組織膜片覆蓋缺損，可通過三次凍融循環(huán)使其徹底失活(以防止暴露在底層修復(fù)基質(zhì)中的生長因子以后，污染細(xì)胞過度生長)?；蛘?，生物可降解膜可以是人工(如聚乳酸膜片，透明質(zhì)酸膜片和薄(細(xì))膠原網(wǎng))或天然的(如骨膜，軟骨膜)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用生長因子時，并不優(yōu)選天然的骨膜或軟骨覆蓋膜，因?yàn)檫@種因子會刺激這些覆蓋膜中的細(xì)胞，從而會污染缺損區(qū)域。但是，當(dāng)單獨(dú)使用形成層時，通常不構(gòu)成影響。
使用滑膜組織膜作為覆蓋膜來覆蓋關(guān)節(jié)軟骨缺損，比現(xiàn)有技術(shù)中含骨膜組織或筋膜的覆蓋膜有優(yōu)勢。滑膜組織可更為完全地轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞和軟骨，并與周圍的軟骨組織更好地整合。骨膜組織和筋膜典型地含有許多成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞不能被轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞和軟骨，而以疤痕組織存留。無需在其下缺損中添加額外的治療劑，通過轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞和軟骨，滑膜組織膜已足以修復(fù)淺層缺陷。
當(dāng)使用滑膜組織作為覆蓋膜時，優(yōu)選用轉(zhuǎn)化因子處理待治療的組織。還優(yōu)選將轉(zhuǎn)化因子與控釋運(yùn)送系統(tǒng)相結(jié)合使用。該轉(zhuǎn)化因子，單獨(dú)或者與控釋運(yùn)送系統(tǒng)一起，被加入滑膜覆蓋膜；或?qū)⒒じ采w膜浸入轉(zhuǎn)化因子的溶液，單獨(dú)或者與控釋運(yùn)送系統(tǒng)一起。
本發(fā)明比現(xiàn)有技術(shù)的方法更加簡單，快速。例如，本發(fā)明無需存在吸引因子以誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞遷移入缺損部位，也不需要應(yīng)用骨髓衍生的間充質(zhì)細(xì)胞所必需的復(fù)雜提取和純化過程。
在膝蓋中，可從靠近髕后脂墊的隱窩或髕上隱窩中切除滑膜組織，其中存在著大量滑膜組織儲備褶。這種滑膜組織的切除實(shí)際上并不損害關(guān)節(jié)功能?；|的切除并不伴有任何關(guān)節(jié)病理學(xué)，這些組織中的損傷會自發(fā)痊愈。
使用本發(fā)明的滑膜組織覆蓋膜覆蓋被填充的缺損還有一個比現(xiàn)有技術(shù)方法更加顯著的好處整個覆蓋膜本身能夠轉(zhuǎn)化為軟骨組織，并整合到新形成的修復(fù)軟骨中。而且，它還能夠很好地與臨近的天然組織如骨整合。另外，使用轉(zhuǎn)化生長因子很有好處，因?yàn)榛そM織覆蓋膜主要含有生軟骨前體細(xì)胞。
使用本發(fā)明的部分失活的組織覆蓋膜也有益處?；蛘撸梢允褂媒钅じ采w膜。優(yōu)選地，在使用前將這種筋膜覆蓋膜徹底滅活(即，使用前冷凍及融化三次)，以防止成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞類型污染新形成的軟骨組織，避免形成不期望的疤痕組織。
為選擇性地去除巨噬細(xì)胞而不是其它細(xì)胞，則優(yōu)選部分滅活的滑膜組織覆蓋膜?？赏ㄟ^單個凍融循環(huán)而完成，或其它本領(lǐng)域已知的方式來選擇性去除巨噬細(xì)胞和其它炎癥細(xì)胞(如可使用抗巨噬細(xì)胞抗體或其它物質(zhì)來選擇性地中和巨噬細(xì)胞從而從滑膜或其它組織中去除巨噬細(xì)胞)。
在上述的每一個具體實(shí)施方式
中，可局部使用抗炎劑來防止巨噬細(xì)胞遷移，活化和增殖，以及形成血管翳?？寡讋┌ㄧ摅w藥物如強(qiáng)的松，和非甾體抗炎藥物(“NSAIDs”)，如布洛芬，酮洛芬，吡羅昔康，萘普生，舒林酸，阿司匹林，膽堿次水楊酸鹽(cholinesubsalicylate)，二氟尼柳，非諾洛芬，吲哚美辛，甲氯芬那酸，雙水楊酸酯，托美丁和水楊酸鎂。這種抗炎劑可容納在含有滑膜組織或細(xì)胞的基質(zhì)內(nèi)，以控釋運(yùn)送系統(tǒng)施用給缺損處，或?qū)⑵渲糜趯盈B的滑膜膜片之間。運(yùn)送系統(tǒng)的實(shí)例包括聚(乳)酸(PLA)，聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)或聚(ε-己內(nèi)酯)(PCL)微球，脂質(zhì)體，生物可侵蝕聚合物，與硫酸肝素蛋白聚糖化學(xué)相連的膠原纖維以及基于碳水化合物的微粒。
在前述的每一具體實(shí)施方式
中，可通過自體移植滑膜組織或細(xì)胞來完成軟骨修復(fù)，即來自相同的個體，或者，也可通過異體移植滑膜組織或細(xì)胞完成軟骨修復(fù)。異體移植可能需要同時施用本領(lǐng)域已知的免疫抑制治療。
本發(fā)明的滑膜組織覆蓋膜還可與其它本領(lǐng)域已知的軟骨修復(fù)技術(shù)一起使用，包括但不限于美國專利5,206,023，5,270,300和5,853,746所公開的技術(shù)。
發(fā)明詳述為更好地理解本發(fā)明，提供下述詳細(xì)的說明。說明中使用了下述術(shù)語。
抗血管生成劑在本文中，是指具有防止血管從下面的骨組織向內(nèi)生長入軟骨組織中的生物活性的任何化合物或組合物，如抗侵襲因子(anti-invasive factor)，軟骨衍生的血管生成抑制劑、制管張素、金屬蛋白酶抑制劑、抗血管生成誘導(dǎo)因子(包括bFGF和內(nèi)皮細(xì)胞刺激血管生成因子(ESAF))的抗體，蘇拉明(Germanin，Bayer AG，Germany)，煙曲霉素，煙曲霉素類似物和AGM-1470[Peacock，D.J.等，Cellular Immunology，160，178-84(1995)]。測定抗血管生成劑的體內(nèi)和體外試驗(yàn)是本領(lǐng)域公知的技術(shù)[如Moses，M.A.等，Clinical & Exptl.Rheumatology，11(Suppl.8)，567-69(1993)；Moses，M.A.等，J.CellBio.，119(2)，475-82(1992)；Moses，M.A.等，Science，248，1408-10(1990)；Ingber，D等，Nature，348(6)，555-57(1990)]。
關(guān)節(jié)鏡檢查本文指使用關(guān)節(jié)鏡來檢查或進(jìn)行關(guān)節(jié)外科手術(shù)。
形成層細(xì)胞本文指在關(guān)節(jié)和骨的軟骨膜及骨膜的形成層中存在的細(xì)胞。
軟骨本文指結(jié)締組織的一種類型，其含有軟骨細(xì)胞，該細(xì)胞包埋在細(xì)胞間物質(zhì)(通常稱為“軟骨基質(zhì)”)中，該基質(zhì)含有膠原纖絲(主要為II型膠原以及較少的其它類型，如IX和XI型)，多種蛋白聚糖(如硫酸軟骨素-，硫酸角質(zhì)素-和硫酸皮膚素-蛋白聚糖)，其它蛋白和水。這里所用的軟骨包括關(guān)節(jié)軟骨和半月板軟骨。關(guān)節(jié)軟骨覆蓋著關(guān)節(jié)中骨部分的表面，可使關(guān)節(jié)活動而無直接的骨與骨接觸，從而防止并列的骨表面的磨損和傷害。多數(shù)正常的健康關(guān)節(jié)軟骨還被描述為“透明”的，即具有毛玻璃的外觀特點(diǎn)。半月板軟骨通常存在于經(jīng)受震動和運(yùn)動的關(guān)節(jié)中。這種半月板軟骨的位置包括顳下頜關(guān)節(jié)，胸鎖關(guān)節(jié)，肩峰鎖骨關(guān)節(jié)，腕關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)[Gray’s Anatomy(New YorkBountyBooks，(1977)]。
細(xì)胞粘附促進(jìn)因子本文指含有三肽Arg-Gly-Asp的任何化合物或組合物，其能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外物質(zhì)粘附，包括纖連蛋白和其它肽，甚至小至四肽[Ruoslathi等，Cell，44，517-518(1986)]。
軟骨細(xì)胞本文指能夠產(chǎn)生軟骨組織成分的細(xì)胞，所述成分如II型軟骨纖絲和纖維及蛋白聚糖。
覆蓋膜本文指可在移植后用于覆蓋被填充的缺損部位以防止細(xì)胞丟失到臨近空間的任何材料，以及可被置于全層缺損的骨缺損部分和軟骨缺損部分之間的任何材料，以防止細(xì)胞遷移以及血管從骨缺損部分侵入全層缺損的軟骨缺損部分。本發(fā)明方法和組合物中所用的膜優(yōu)選是生物可降解的，可包括滑膜，聚乳酸膜片，透明質(zhì)酸膜片，薄(細(xì))膠原網(wǎng)，骨膜，軟骨膜或筋膜?；ねǔ＾D(zhuǎn)化為軟骨組織，整合到修復(fù)軟骨組織中。非生物可降解的膜包括特氟隆(Goretex)，Millipore膜，或Verigen膜。
成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)FGF多肽家族的任何成員[Gimenez-Gallego等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，135，541-548(1986)；Thomas等，Trends Biochem.Sci.，11，81-84(1986)]或其衍生物，可從天然，合成或重組來源獲得，其能夠在體外刺激多種細(xì)胞的DNA合成及細(xì)胞分裂[測定請參見如Gimenez-Gallego等，1986，同上；Canalis等，J.Clin.Invest.，81，1572-1577(1988)]，所述細(xì)胞包括初級成纖維細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，血管和角膜內(nèi)皮細(xì)胞，成骨細(xì)胞，成肌細(xì)胞，平滑肌和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[Thomas等，1986，同上]。根據(jù)FGF的等電點(diǎn)(pI)，可將其分為酸性(a FGF)或堿性(b FGF)FGF。
基質(zhì)本文中指多孔復(fù)合固體或半固體物質(zhì)，其具有足夠大的孔或空間允許細(xì)胞入住其中。術(shù)語“基質(zhì)”包括基質(zhì)-形成材料，即，能夠在軟骨或骨的缺損部位基質(zhì)-形成材料?；|(zhì)-形成材料可能需要加入聚合劑以形成基質(zhì)，如向含有纖維蛋白原的溶液中加入凝血酶以形成纖維蛋白基質(zhì)。其它的基質(zhì)材料包括但不限于膠原，膠原和纖維蛋白的組合，瓊脂糖(如Sepharose)，明膠，hyaluronan，透明質(zhì)酸與膠原相結(jié)合，可光聚合的基質(zhì)，基于白蛋白的基質(zhì)，基于聚乳酸的基質(zhì)，基于聚羥基乙酸的基質(zhì)和基于纖維蛋白的基質(zhì)。磷酸鈣鹽，如磷酸三鈣，羥基磷灰石或其它能夠形成固體基質(zhì)的鈣鹽都可單獨(dú)，或與其它基質(zhì)材料結(jié)合用于治療骨缺損。
增殖(促有絲分裂)劑本文指任何能夠刺激細(xì)胞體外增殖的化合物或組合物，包括肽，蛋白，和糖蛋白。檢測肽，多肽和其它化合物的增殖(促有絲分裂)活性的體外試驗(yàn)是本領(lǐng)域公知的技術(shù)[例如參見，Canalis等，1988，同上；Gimenez-Gallego等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，135，541-548(1986)；Rizzino，“SoftAgar Growth Assay for Transforming Growth Factors and MitogenicPeptides”，Methods Enzymol.，146A(New YorkAcadamic Press，1987)，341-52；Dickson等，“Assay of Mitogen-Induced Effects onCellular Incorporation of Precursors for Scavengers，de novo and NetDNA Synthesis”，Methods Enzymol.，146A(New YorkAcadamic Press，1987)，329-40]。測定化合物或組合物增殖(促有絲分裂)活性的一個標(biāo)準(zhǔn)方法是在體外測試其誘導(dǎo)未轉(zhuǎn)化細(xì)胞在軟瓊脂中無貼壁依賴性生長的能力[如Rizzino，1987，同上]。還已知其它的促有絲分裂活性試驗(yàn)系統(tǒng)[如Gimenez-Gallego等，1986，同上；Canalis等，1988，同上；Dickson等，1987，同上]。通常，物質(zhì)的促有絲分裂作用與濃度密切相關(guān)，在比促有絲分裂作用的最佳濃度范圍更低或更高的濃度下其效應(yīng)可能逆轉(zhuǎn)。
滑膜細(xì)胞本文指與滑膜生理上相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞，或存在于滑膜下空間的細(xì)胞；來自關(guān)節(jié)滑膜或滑液的細(xì)胞。當(dāng)暴露于適當(dāng)?shù)拇碳r，滑膜細(xì)胞會分化并轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞?；ぱ苌男迯?fù)細(xì)胞包括間充質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，去分化的軟骨細(xì)胞，滑膜襯細(xì)胞，和滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化因子本文指能夠誘導(dǎo)例如滑膜衍生細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的任何肽，多肽，蛋白或任何其它化合物或組合物。這還包括導(dǎo)入(例如通過轉(zhuǎn)染)細(xì)胞內(nèi)用于修復(fù)缺損的基因的產(chǎn)物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的體外試驗(yàn)來檢測該化合物或組合物誘導(dǎo)或刺激細(xì)胞產(chǎn)生軟骨特異性蛋白聚糖和II型膠原的能力[Seyedin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，2267-71(1985)；Seyedin等，Path.Immunol.Res.，7，38-42(1987)]。
轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)TGF-β多肽家族的任何成員[DerynckR等，Nature，316，701-705(1985)；Roberts等，“The transforminggrowth factor-β’s”，Peptide growth factors and their receptorsI(BerlinSpringer Verlag，1990)，419頁]或其衍生物，可從天然，合成或重組來源獲得。其具有TGF-β的特點(diǎn)，能夠刺激正常大鼠腎(NRK)細(xì)胞生長并在軟瓊脂試驗(yàn)中形成集落[Roberts等，“Purification ofType βTransforming Growth Factors From Nonneoplastic Tissues”，Methods for Preparation of Media，Supplements，and Substrata forSerum-Free Animal Cell Culture(New YorkAlan R.Liss，Inc.，1984)]，并能夠誘導(dǎo)滑膜衍生的修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，這已經(jīng)被其在體外誘導(dǎo)或刺激細(xì)胞產(chǎn)生軟骨特異性蛋白聚糖和II型膠原的能力所證實(shí)。[Seyedin等，1985，同上]。
制備缺損并獲得滑膜組織為實(shí)施本發(fā)明的軟骨缺損或損傷治療方法，首先鑒定待修復(fù)的關(guān)節(jié)軟骨缺損。可通過關(guān)節(jié)鏡檢查關(guān)節(jié)簡便地肉眼鑒定動物中的軟骨缺損，或在開放性外科手術(shù)中簡單地檢查缺損或損傷。還可使用計算機(jī)輔助的斷層攝影(CAT掃描)，X-射線檢查，磁共振成像(MRI)，分析滑液或血清標(biāo)記，或本領(lǐng)域已知的任何其它方法來推論性地鑒定軟骨缺損。
一旦鑒定了缺損，在修復(fù)前或修復(fù)時，外科醫(yī)生可選擇外科手術(shù)來修飾缺損以提高缺損物理地保持本文所述治療方法所加入的滑膜組織，細(xì)胞和/或基質(zhì)材料的能力。優(yōu)選地，缺損處具有或被處理成具有垂直的邊緣，或側(cè)凹，而不要形成平的或很淺的凹面，以更好地容納如本文所述治療方法中加入的滑膜組織，細(xì)胞和/或基質(zhì)材料?？赏ㄟ^一種稱為“微骨折”的過程處理全層和淺層缺損，以產(chǎn)生分散的出血區(qū)域，這涉及在軟骨下骨板整齊地穿孔。釋放的骨髓成分會形成外科手術(shù)誘發(fā)的凝塊，其能夠?yàn)樾陆M織形成提供豐富環(huán)境[Steadman等，Clin.Orthop.，391 Suppl.，S362-69(2001.Oct)]。
在一個
具體實(shí)施例方式
中，在局部麻醉下進(jìn)行小關(guān)節(jié)鏡檢查或外科干預(yù)?？稍谝浦睬叭芜x地用蛋白聚糖降解酶或其它材料處理缺損部位，以改善移植的滑膜組織，細(xì)胞或基質(zhì)的粘附。使用無菌的吸收巾沾吸該區(qū)域從而干燥缺損的表面，用滅菌的酶溶液填充缺損空間2-10分鐘，使軟骨表面以及距缺損表面約1-2μm深局部的蛋白聚糖降解?？蓡为?dú)地或相結(jié)合地使用在滅菌緩沖水溶液中的多種酶來降解蛋白聚糖。應(yīng)調(diào)整該溶液的pH值使酶活性達(dá)到最佳。
可用于本發(fā)明方法中降解蛋白聚糖的酶包括軟骨素酶ABC，軟骨素酶AC，透明質(zhì)酸酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，鏈霉蛋白酶，溶基質(zhì)素和Staph V8蛋白酶[Jurgensen K.等，J.Bone Joint Surg.Am.，79(2)，185-93(1997)；Hunziker E.B.等，J.BoneJoint Surg.Br.，80(1)，144-50(1998)]?？筛鶕?jù)酶溶液的活性來決定特定的酶或酶組合的適當(dāng)濃度。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，用1U/ml濃度的軟骨素酶AC滅菌溶液填充缺損，進(jìn)行消化4分鐘。優(yōu)選的軟骨素酶AC濃度可根據(jù)實(shí)施例1所述確定。所用的任何其它酶都應(yīng)該以一定的濃度，持續(xù)一定時間，以使僅深至約1-2μm處的表淺蛋白聚糖被降解。
應(yīng)用酶溶液的時間應(yīng)保持在降解主要在修復(fù)區(qū)域中的蛋白聚糖的最低限度。1U/ml的軟骨素酶ABC或AC，消化時間大于10分鐘，可能會對缺損區(qū)域之外的蛋白聚糖產(chǎn)生不必要的和可能有害的降解作用。另外，消化時間大于10分鐘會使整個方法的總耗時延長。該方法的總耗時應(yīng)盡可能維持在最短時間內(nèi)，特別是在開放性的關(guān)節(jié)切開術(shù)過程中，因?yàn)楸┞对诳諝庵驴赡軙浌窃斐蓚Mitchell等，(1989)同上]。由于這些原因，在本發(fā)明方法的包括應(yīng)用酶消化降解蛋白聚糖步驟的具體實(shí)施方式
中，優(yōu)選消化時間小于10分鐘，最優(yōu)選消化時間小于5分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的方法，當(dāng)酶降解了缺損表面的蛋白聚糖之后，應(yīng)該將酶溶液從缺損處去除?？赏ㄟ^使用帶有細(xì)吸頭的吸引器然后用棉狀海綿擦拭來去除酶溶液。或者，可只用棉狀海綿擦拭吸收來去除酶溶液。
去除酶溶液之后，用滅菌的生理鹽水(如0.15M NaCl)徹底清洗缺損處，優(yōu)選清洗三次。然后干燥經(jīng)清洗的缺損處?？墒褂脽o菌紗布或棉質(zhì)物干燥缺損部位。
為進(jìn)行術(shù)中的滑膜再植或移植，必須大面積地清洗掉蛋白聚糖降解酶，以去除任何蛋白酶，從而防止加入的生長因子失活。
作為另一種選擇，或者除酶處理步驟之外，還可將化合物敷于缺損處，如纖維蛋白膠(fibrin glue)或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase)，以提高基質(zhì)對缺損部位的粘附性。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，當(dāng)缺損處經(jīng)酶處理后已被清洗并干燥后，將纖維蛋白膠或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶應(yīng)用于缺損處。纖維蛋白膠會促進(jìn)基質(zhì)纖絲與缺損表面軟骨膠原纖絲的化學(xué)結(jié)合(交聯(lián))[參見Gibble等，Transfusion，30(8)，741-47(1990)]?？墒褂棉D(zhuǎn)谷氨酰胺酶來達(dá)到同樣的效果[例如參見，Ichinose等，J.Biol.Chem.，265(23)，13411-14(1990)；“Transglutaminase”，V.A.Najjar和L.Lorand編，Martinus Nijhoff Publishers(Boston，1984)]。還可使用縫合、燒灼或除纖維蛋白膠或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶之外的能夠促進(jìn)胞外物質(zhì)粘附的化合物。
對患有缺損的患者在含缺損的關(guān)節(jié)處進(jìn)行局部麻醉，或者全身麻醉，使用適當(dāng)?shù)耐饪破餍?如活組織檢查器械，手術(shù)刀或關(guān)節(jié)鏡)從關(guān)節(jié)中取出適量的滑膜和/或滑液。在膝關(guān)節(jié)中，優(yōu)選從膝關(guān)節(jié)脂墊或其附近的遠(yuǎn)端隱窩中取出滑膜材料，或者在髕上隱窩處取。當(dāng)可使用額外的組織塊完全填充缺損時，還可使用含有脂墊組織的滑膜組織。通常，應(yīng)該從儲備褶(reserve folds)的區(qū)域處取滑膜，而不是直接與關(guān)節(jié)軟骨表面相對處。
使用滑膜組織所獲的滑膜組織可用于快速的術(shù)中滑膜移植過程?？扇芜x地用單一凍融循環(huán)使滑膜組織部分失活，然后置于缺損處。含有增殖劑和/或轉(zhuǎn)化因子的基質(zhì)可任選地與滑膜組織共同使用來填充缺損。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
中，滑膜組織被直接移植到缺損部位。為防止移植的滑膜組織掉到關(guān)節(jié)間隙內(nèi)，可用薄層生物可降解覆蓋膜覆蓋缺損部位表面。該覆蓋膜可以是人工或天然的(如滑膜，如下所述)。用縫合線，纖維蛋白膠，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，燒灼等將該覆蓋膜封到缺損部位邊緣。如果使用縫合線與滑膜相連，該縫合線可用適當(dāng)濃度的轉(zhuǎn)化因子如BMP-2浸透，以促進(jìn)膜中的滑膜細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，將滑膜從隱窩中取出，并切成非常小的碎片(即，切碎成小碎塊)用于移植。可用膠原酶和胰蛋白酶簡短地消化切碎的滑膜(30-45分鐘)，然后在手術(shù)室里快速純化。或者，可利用物理刮削和/或?qū)悄せ蜍浌悄そM織的溫和蛋白水解消化作用獲得并切碎形成層細(xì)胞。將切碎的滑膜或形成層組織混合到基質(zhì)中，并與基質(zhì)一起移植到缺損部位。優(yōu)選該基質(zhì)含有趨化/增殖劑，以使得細(xì)胞繁殖填充整個基質(zhì)，該基質(zhì)還優(yōu)選含有與控釋釋放系統(tǒng)一起的轉(zhuǎn)化因子，以在該基質(zhì)內(nèi)誘導(dǎo)軟骨組織轉(zhuǎn)化?？捎没そM織覆蓋膜或其它膜覆蓋整個基質(zhì)，以使得基質(zhì)保留在缺損處。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，一層或多層被切除的滑膜膜片被相互層疊堆積直到缺損處被填充滿?？蓪㈨攲拥倪吘?，以及任選地下層的邊角縫合到或膠到缺損處的邊緣，以保留整個層疊在原位。在各層之間存在轉(zhuǎn)化生長因子以誘導(dǎo)滑膜片的軟骨轉(zhuǎn)化，優(yōu)選使用如上所述的控釋運(yùn)送體系。這可通過在每層間沉積一薄層基質(zhì)層(如纖維蛋白或膠原)來完成，所述基質(zhì)層已浸透了轉(zhuǎn)化因子，以誘導(dǎo)組織轉(zhuǎn)化為軟骨?；蛘?，可向滑膜膜片之間加入含有轉(zhuǎn)化因子的微粒，微球，納米球或脂質(zhì)體，無需基質(zhì)。另一實(shí)施方式是將含有這類因子的乳劑置于膜片之間?；蛘呖稍谠僦仓皩⒒て菰谵D(zhuǎn)化生長因子溶液中。
上述
具體實(shí)施例方式
中的被切碎滑膜，形成層組織和滑膜片還可通過單次的凍融循環(huán)而使其部分失活，以減少細(xì)胞密度，并減少不期望的細(xì)胞?；蛘呖墒褂每咕奘杉?xì)胞抗體或其它物質(zhì)來耗盡巨噬細(xì)胞群。
還可使用部分轉(zhuǎn)化的滑膜組織來填充缺損處。在第一次外科干預(yù)中，浸透了轉(zhuǎn)化生長因子以進(jìn)行緩釋的基質(zhì)墊被縫合到并貼附到關(guān)節(jié)滑膜的隱窩處，或者連到就在緊靠滑膜囊之外的滑膜組織上。該手術(shù)后8-14天，該基質(zhì)墊下的組織將已經(jīng)轉(zhuǎn)化為軟骨樣組織。然后將其取出并用部分轉(zhuǎn)化的滑膜組織層疊堆積填充缺損處。還可在這種組織片間加入本領(lǐng)域公知的其它轉(zhuǎn)化因子和維持因子(如IGF I，IGF II和IGF-BP’s)。
在缺損延伸到血管化組織(如軟骨下骨骼和軟骨下骨髓間隙(或靠近豐富血管化的滑膜處))的區(qū)域中，有可能會有向內(nèi)生長的血管污染缺損處的修復(fù)組織。為防止這種不期望的血管向內(nèi)生長，可向基質(zhì)中加入抗血管生成因子，或在滑膜組織各層之間，滑膜小碎塊之中或滑膜衍生的移植軟骨細(xì)胞或滑膜細(xì)胞之中沉積該因子。
使用滑膜細(xì)胞如上所述制備的滑膜樣品被部分消化，使得單個的滑膜襯細(xì)胞和滑膜下成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞能夠從膜組織中釋放出來?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的胰蛋白酶酶解或其它從周圍組織離解細(xì)胞的方法。收集單個的細(xì)胞(如，通過利用Ficoll密度梯度的差示沉降)并在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下體外培養(yǎng)，確保其快速增殖和擴(kuò)增(可加入增殖劑使得該步驟更快實(shí)現(xiàn))?；ぜ?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域公知的技術(shù)[Taguchi K等，Cell Struct.Funct.，22，443-53(1997)，Rodel J等，Exp.Toxicol.Pathol.，48，243-7(1996)]。在幾個星期內(nèi)，滑膜細(xì)胞會擴(kuò)增到足夠的數(shù)目(如10000-300000個細(xì)胞/ml溶液或基質(zhì))，根據(jù)缺損的大小，即可將其移植到缺損處。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞被誘導(dǎo)在體外分化。已顯示間充質(zhì)干細(xì)胞可被誘導(dǎo)在體外分化[Caplan和Haynesworth，美國專利No.5,486,359]。還已顯示在體外用BMP(骨形成蛋白)刺激的滑膜衍生的間充質(zhì)型細(xì)胞可分化為軟骨[Iwata等，Clin.Orthop.，296，295-300(1993)]。
在該
具體實(shí)施例方式
中，在TGF-β和/或BMP(優(yōu)選濃度在下文給出)的存在下，培養(yǎng)從患者取出的滑膜細(xì)胞，以誘導(dǎo)其分化為軟骨細(xì)胞。之后將所得到的軟骨細(xì)胞植入到缺損部位，如前述實(shí)施方式中所述，即作為懸液或作為基質(zhì)體系的一部分。
在另一個實(shí)施方式中，使被TGF-β和/或BMP誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的滑膜細(xì)胞在體外產(chǎn)生軟骨組織。對軟骨組織的大小和形狀進(jìn)行塑造以充分適合缺損后，將由此制備的軟骨組織植入缺損部位?；蛘撸妹覆糠窒浌腔|(zhì)，以收集產(chǎn)生軟骨的軟骨細(xì)胞，然后將其以懸浮物或固體團(tuán)塊移植。
使用滑膜組織覆蓋膜當(dāng)使用滑膜作為覆蓋膜時，優(yōu)選進(jìn)行部分滅活的步驟，因?yàn)樵摻M織含有巨噬細(xì)胞，其不利于軟骨組織形成，因?yàn)槠淠軌驅(qū)е卵装Y細(xì)胞增殖或產(chǎn)生信號物質(zhì)，該物質(zhì)會吸引血管，這樣會導(dǎo)致不期望的骨化?？赏ㄟ^單次快速的凍融過程去除巨噬細(xì)胞，該過程會減少滑膜覆蓋膜中細(xì)胞的數(shù)目。這主要會去除巨噬細(xì)胞，而間充質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目盡管有所下降，仍足以形成軟骨細(xì)胞，并由此最終形成軟骨。另外，通過減少細(xì)胞密度，部分滅活會產(chǎn)生出更適于在修復(fù)組織中形成軟骨的生理細(xì)胞密度。還可額外使用本領(lǐng)域已知的去除巨噬細(xì)胞的其它方法(如抗巨噬細(xì)胞抗體)，或作為備選的一種方法。
還可使用預(yù)先轉(zhuǎn)化的滑膜來替代如上所述的直接滑膜組織自體移植步驟來覆蓋缺損。該方法使用兩步外科手術(shù)法。第一個步驟是關(guān)節(jié)鏡干預(yù)，其中將浸透了轉(zhuǎn)化因子(如BMP-2，TGF-β)的基質(zhì)墊與下述縫合(1)隱窩中的滑膜，(2)就在緊靠滑膜間隙之外的滑膜組織，包括脂墊，或(3)滑膜下結(jié)締組織，靠近滑膜襯細(xì)胞。選項(xiàng)(2)和(3)的優(yōu)點(diǎn)在于無需打開關(guān)節(jié)。3-4周后，該基質(zhì)墊所面向的滑膜將會轉(zhuǎn)化為軟骨樣組織。第二個步驟是外科手術(shù)干預(yù)，將該軟骨樣組織切除，并移植到缺損處，使其填充和/或覆蓋缺損。在帶有很薄關(guān)節(jié)軟骨層的小關(guān)節(jié)(如指關(guān)節(jié))中，這種部分轉(zhuǎn)化的滑膜可能足以填充整個缺損間隙。這種在膝關(guān)節(jié)中被誘導(dǎo)并自體移植到較小的指關(guān)節(jié)(或其它關(guān)節(jié))的部分轉(zhuǎn)化滑膜，可用于重建目的。
本發(fā)明所用的滑膜覆蓋膜作為覆蓋以維持組織和/或基質(zhì)材料，可上下翻轉(zhuǎn)或者取生理方向；每種方式都可行。可作為完全有活力的或部分失活的材料應(yīng)用，以消除特異性細(xì)胞類型，優(yōu)化結(jié)果。
在本發(fā)明包括使用滑膜覆蓋膜的具體實(shí)施方式
中，可使用滑膜覆蓋膜覆蓋全層缺損的底部，或者微骨折的全層或淺層缺損(僅到達(dá)軟骨下骨板)的底面。這種覆蓋膜可在這些缺損中作為結(jié)構(gòu)和功能屏障。在含有一個或多個出血點(diǎn)的全層或淺層缺損中，可在缺損骨部分的基底部置入生骨因子，還可任選地利用控釋系統(tǒng)(如微球，脂質(zhì)體或容納在基質(zhì)中)，然后用第一層滑膜覆蓋膜覆蓋。任選地，可在第一層滑膜覆蓋膜下加入血管生成劑以進(jìn)一步促進(jìn)骨形成，盡管血液中的因子也會促進(jìn)骨形成?？墒褂每p合線，燒灼，膠，其它方式，或不用任何方式，將滑膜覆蓋膜固定到位?？稍诘谝粚踊じ采w膜周邊使用抗血管生成劑以抑制血管侵入其上的軟骨修復(fù)部位。
在第一層滑膜覆蓋膜之上，即不臨近缺損的骨部分，可單獨(dú)或與基質(zhì)一起使用生軟骨劑以促進(jìn)軟骨形成。優(yōu)選用層疊的滑膜填充缺損，中間插入生軟骨劑。除利用滑膜層疊物之外，還可以單獨(dú)或與基質(zhì)一起，使用基于細(xì)胞的治療手段，以促進(jìn)軟骨形成。這種基于細(xì)胞的治療包括應(yīng)用滑膜細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞，用生軟骨基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或任何生軟骨細(xì)胞/基質(zhì)系統(tǒng)。
已填充了生軟骨細(xì)胞/基質(zhì)系統(tǒng)后，優(yōu)選用第二層滑膜覆蓋膜覆蓋缺損空隙的頂端，該覆蓋膜可直接覆蓋生軟骨劑，以促進(jìn)其完全轉(zhuǎn)化為軟骨組織，并同時作為填充在缺損空隙的生軟骨細(xì)胞/基質(zhì)系統(tǒng)的保留裝置起作用。
以上
具體實(shí)施例方式
中的第一層滑膜覆蓋膜可行使錨定裝置的作用，在全層缺損中行使三種修復(fù)功能(1)滑膜覆蓋膜朝向全層缺損骨部分或者淺層缺損出血點(diǎn)的那一面，會參與骨形成，并在大約1-4星期內(nèi)最終與新形成的骨融合；(2)滑膜覆蓋膜背離缺損骨部分的那一面將參與軟骨形成，并最終與新形成的軟骨融合；以及(3)第一層滑膜覆蓋膜本身會作為暫時的屏障，阻止血管從骨部分或從缺損的脂肪組織向上生長，并且還阻止多種來源的干細(xì)胞從骨和脂肪組織向缺損的軟骨修復(fù)部位進(jìn)行不期望的遷移和污染。
基質(zhì)和其它修復(fù)材料可在本發(fā)明中用于填充或敷于軟骨缺損的基質(zhì)材料包括纖維蛋白原(由凝血酶激活以在缺損或損傷處形成纖維蛋白)，膠原，瓊脂糖，明膠和任何其它可生物降解的材料，其能夠形成多孔基質(zhì)，所述孔的大小足以使滑膜細(xì)胞或軟骨細(xì)胞進(jìn)入并在整個基質(zhì)中增殖，該基質(zhì)可被降解并在修復(fù)過程中可被軟骨替代。
本發(fā)明方法所用基質(zhì)可預(yù)制或在原位形成，例如，通過聚合化合物和組合物如纖維蛋白原，以形成纖維蛋白基質(zhì)?？深A(yù)制的基質(zhì)包括膠原(如膠原海綿和膠原織物)，化學(xué)修飾的膠原，明膠珠或海綿，成膠物質(zhì)如瓊脂糖或任何其它成膠或復(fù)合物質(zhì)，該物質(zhì)由基質(zhì)材料構(gòu)成，所述基質(zhì)材料可以填充缺損，并使培養(yǎng)的或天然的滑膜細(xì)胞或軟骨細(xì)胞在基質(zhì)中定居，或上物質(zhì)的混合物。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，使用纖維蛋白原或切碎的滑膜組織的溶液形成基質(zhì)，在即將使用前向其中加入凝血酶，使其開始聚合?？墒褂?.5-5mg/ml緩沖水溶液的纖維蛋白原濃度。優(yōu)選使用1mg/ml緩沖水溶液的纖維蛋白原溶液。該纖維蛋白原溶液在缺損部位的聚合會產(chǎn)生孔徑足夠大(如約50-200μM)的基質(zhì)，可以使滑膜細(xì)胞或軟骨細(xì)胞自由入住基質(zhì)并增殖，以填充由基質(zhì)占據(jù)的缺損部位空間。優(yōu)選地，在即將應(yīng)用纖維蛋白原溶液前，向其中加入足量的凝血酶，使外科醫(yī)生有充足的時間能夠在完成聚合前，將該材料沉積在缺損處。典型地，凝血酶的濃度應(yīng)該使聚合在數(shù)(2-4)分鐘內(nèi)完成，因?yàn)橐呀?jīng)顯示，將軟骨長時間暴露在空氣中會導(dǎo)致?lián)p傷[Mitchell等，J.Bone JointSurg.，71A，89-95(1989)]。不應(yīng)使用過量的凝血酶，因?yàn)槟改軌蛎盖猩L因子分子并使其失活?？芍苽?0-500單位/ml，優(yōu)選100單位/ml緩沖水溶液的凝血酶溶液，用于加入纖維蛋白原溶液。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，在填充缺損之前，將大約20μl凝血酶(100U/ml)與每ml纖維蛋白原溶液(1mg/ml)混合約200秒。如果加入濃度更低的凝血酶，則聚合速度會更慢?？梢岳斫?，要獲得使纖維蛋白在2-4分鐘內(nèi)聚合的凝血酶溶液量只能大約給出，因?yàn)檫@要視環(huán)境溫度，凝血酶溶液的溫度，纖維蛋白原溶液的溫度等等而定?；蛘?，為方便起見，當(dāng)基質(zhì)溶液已被置于缺損部位后，可將凝血酶置于基質(zhì)溶液的頂端，將其加入，使其擴(kuò)散到基質(zhì)溶液中。通過觀察纖維蛋白原溶液外部樣品的凝血酶誘導(dǎo)的聚合，可以輕松地監(jiān)測填充在缺損部位的凝血酶激活基質(zhì)溶液的聚合情況。優(yōu)選地，在本發(fā)明的組合物和方法中，纖維蛋白基質(zhì)由來自與待治療物種相同的哺乳動物物種血液的纖維蛋白原分子形成。其它物種來源的無免疫原性的纖維蛋白原也可以使用。
還可將含有纖維蛋白和膠原的基質(zhì)，更優(yōu)選含有纖維蛋白和明膠的基質(zhì)，用于本發(fā)明的組合物和方法。膠原性基質(zhì)也可以用于修復(fù)軟骨缺損，包括全層缺損。請注意對于修復(fù)深的全層缺損的骨部分，可使用美國專利Nos.5,270,300和5,853,746所公開的方法。
如果使用膠原作為基質(zhì)材料，可利用Collagen-Vliess(“織物”)，Spongostan，或明膠-血液-混合物來制備足夠粘的溶液，無需聚合劑。還可與聚合劑激活的纖維蛋白原溶液一起使用膠原基質(zhì)，這樣得到組合的基質(zhì)。
當(dāng)使用其它生物可降解化合物制備基質(zhì)時，也可以不必使用聚合劑。例如，可選擇Sepharose溶液，該溶液在39-42℃為液態(tài)基質(zhì)溶液，在35-38℃時變?yōu)楣虘B(tài)(凝膠狀)。Serpharose的濃度應(yīng)使填充缺損的凝膠具有這樣的網(wǎng)格大小使滑膜衍生的修復(fù)細(xì)胞或軟骨細(xì)胞能夠自由占據(jù)基質(zhì)和缺損部位。
使用轉(zhuǎn)化因子和基質(zhì)一旦被置于缺損部位，植入的滑膜組織或滑膜細(xì)胞懸液就會部分自發(fā)地轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，該細(xì)胞最終會生成成熟的軟骨組織，起初會粘附到用蛋白聚糖降解酶處理的表面[Hunziker E.B等，J.Bone JointSurg.Br.，80(1)，144-50(1998)]。優(yōu)選地，可向植入的滑膜組織中加入適當(dāng)濃度的轉(zhuǎn)化因子來誘導(dǎo)均相分化為軟骨細(xì)胞，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，骨形成蛋白(BMP’s)[Majumdar M.K.，J.Cell.Physiol.，189(3)，275-84(2001)]，軟骨衍生的形態(tài)發(fā)生蛋白(CDMP)[Luyten F.P.，Acta Orthop.Scand.Suppl.，266，51-4(1995)]，印度刺猬蛋白(indianhedgehog protein)(IHH蛋白)[St-Jacques B等，Genes Dev.，13(16)，2072-86(1999)]，sonic hedgehog蛋白(SHH蛋白)[Iwamoto M.等，Crit.Rev.Oral Biol.Med.，10(4)，477-86(1999)]或SOX-9[Kolettas E等，Rheumatology，40(10)，1146-56(2001)]。優(yōu)選以控釋運(yùn)送系統(tǒng)施用轉(zhuǎn)化因子。持續(xù)地增殖和產(chǎn)生軟骨會填充缺損處，從而修復(fù)缺損。由于新的軟骨形成并變得致密，該軟骨替代生物可降解基質(zhì)，而薄層覆蓋膜會溶解或整合到修復(fù)組織中，損傷即被修復(fù)。還可使用本領(lǐng)域已知的維持因子(如IGF I，IGF II和IGF-BP’s)，來穩(wěn)定缺損內(nèi)的修復(fù)細(xì)胞群。
可用于本發(fā)明組合物和方法的促進(jìn)軟骨修復(fù)的轉(zhuǎn)化因子包括任何肽，多肽，蛋白或任何其它化合物和組合物，其能夠誘導(dǎo)滑膜衍生的修復(fù)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，該軟骨細(xì)胞可以產(chǎn)生軟骨特異性蛋白聚糖和II型膠原。轉(zhuǎn)化因子還可以誘導(dǎo)細(xì)胞形成骨或其它細(xì)胞類型?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的實(shí)驗(yàn)來檢測化合物或組合物誘導(dǎo)或刺激細(xì)胞生成軟骨特異性蛋白聚糖和II型膠原的能力[例如參見，Seyedin等，1985，同上；Seyedin等，1987，同上]?？捎糜诒景l(fā)明組合物和方法的轉(zhuǎn)化因子包括，如TGF-β，TGF-α，F(xiàn)GF(酸性或堿性)和BMP，包括BMP-2。這些轉(zhuǎn)化因子可單獨(dú)或相結(jié)合使用。也可使用這些因子的二聚物和多聚物。另外，TGF-β可與EGF結(jié)合使用。
特別地，TGF-βI或TGF-βII或BMP-2可用作轉(zhuǎn)化因子。其它的TGF-β形式(如TGF-βIII，TGF-βIV，TGF-βV，或TGF-β超家族的任何成員)或具有TGF-β活性的多肽(參見Roberts，1990，同上)也可以用于該目的，以及有待在將來檢測的該物質(zhì)的其它形式和其它生長因子。
在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，TGF-β的濃度優(yōu)選大于200ng/ml基質(zhì)，最優(yōu)選大于或等于500ng/ml溶液或基質(zhì)。或者，可使用BMP作為轉(zhuǎn)化因子，濃度優(yōu)選為100-2000ng/ml?？梢岳斫庹T導(dǎo)滑膜細(xì)胞分化的TGF-β或BMP的優(yōu)選濃度會隨著待治療的特定物種或個體而有所改變。
在本發(fā)明組合物中的轉(zhuǎn)化因子容納在基質(zhì)中應(yīng)用于缺損處。這樣它們的存在就限制在非常局限的部位。這是為防止它們自由地注入或輸入關(guān)節(jié)間隙。這種自由輸入可能會產(chǎn)生刺激周圍滑膜的細(xì)胞的不良作用，而產(chǎn)生關(guān)節(jié)滲出液。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，待植入的組織或基質(zhì)除TGF-β或BMP作為轉(zhuǎn)化因子外，還含有抗血管生成劑。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，用蛋白聚糖降解酶和/或如上述的另一種粘附增強(qiáng)化合物處理缺損部位。首先將滑膜組織或培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞加入生物可降解基質(zhì)系統(tǒng)。然后將含有適當(dāng)濃度(如10000-300000細(xì)胞/毫升組織，溶液或基質(zhì))滑膜組織或細(xì)胞的基質(zhì)系統(tǒng)植入到缺損處。如上所述，可將一薄層人工或天然的覆蓋膜密封在缺損表面上，以防止組織丟失到關(guān)節(jié)間隙；但是，特別是當(dāng)處理較小缺損時，可不必使用覆蓋膜，因?yàn)橛糜谔畛淙睋p處的含有滑膜組織或細(xì)胞的基質(zhì)會保持在缺損之內(nèi)。用于填充缺損的滑膜組織內(nèi)的細(xì)胞會在基質(zhì)系統(tǒng)內(nèi)增殖。
在使用如上所述基質(zhì)系統(tǒng)的具體實(shí)施方式
中，在植入后在基質(zhì)系統(tǒng)內(nèi)會提供轉(zhuǎn)化因子，優(yōu)選TGF-β超家族成員，這樣植入的滑膜細(xì)胞會被誘導(dǎo)分化為產(chǎn)生軟骨的軟骨細(xì)胞?？墒褂眠\(yùn)送系統(tǒng)運(yùn)送轉(zhuǎn)化因子，使得植入的細(xì)胞能夠持續(xù)地，長時間地接觸轉(zhuǎn)化因子。適當(dāng)運(yùn)送系統(tǒng)的實(shí)例包括聚乳酸微球和脂質(zhì)體?？筛鶕?jù)病例的具體參數(shù)，如缺損部位的大小和密度，指定時間靶細(xì)胞的濃度以及所用的轉(zhuǎn)化因子，來決定運(yùn)送方案。這種系統(tǒng)如美國專利5,206,023所公開的。
另外，如果缺損相對于用來填充缺損的滑膜樣品內(nèi)細(xì)胞濃度或細(xì)胞懸液較大，可向滑膜樣品或基質(zhì)中加入增殖劑以擴(kuò)增填充缺損的滑膜細(xì)胞數(shù)目。增殖劑應(yīng)以適當(dāng)?shù)臐舛确秶嬖?，以達(dá)到促進(jìn)缺損內(nèi)滑膜細(xì)胞增殖的效果。優(yōu)選地，相同物質(zhì)也應(yīng)該對細(xì)胞具有趨化作用(如TGF-β的情況)；但是，可使用僅具有增殖作用的因子，特別是存在一層覆蓋膜以維持組織和細(xì)胞在缺損空隙內(nèi)的時侯?；蛘撸瑸榱藢χ糜谌睋p處的細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，隨后誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，可使用兩種不同的物質(zhì)，其中每種都只具備這些特定作用中的一種(趨化或增殖)。這種物質(zhì)在美國專利No.5,206,023中描述。纖連蛋白或其它細(xì)胞粘附促進(jìn)因子也可容納在基質(zhì)中，如美國專利No.5,206,023所述。隨后施用如上所述的轉(zhuǎn)化因子會誘導(dǎo)滑膜樣品中的細(xì)胞或細(xì)胞懸液分化成產(chǎn)生軟骨的軟骨細(xì)胞?？墒褂蒙鲜龅目蒯屵\(yùn)送系統(tǒng)施用增殖劑和轉(zhuǎn)化因子之一或這兩者。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，特別是軟骨缺損達(dá)全層時，可向滑膜組織，細(xì)胞溶液或基質(zhì)中加入適宜濃度范圍的抗血管生成劑，以防止血管長入軟骨組織?？墒褂玫目寡苌蓜┌ㄈ魏尉哂蟹乐寡軓脑谙旅娴墓墙M織或臨近滑膜生長到軟骨組織中的生物活性的物質(zhì)。這種抗血管生成劑如美國專利No.5,853,746描述。可用于本發(fā)明的抗血管生成劑的某些實(shí)例如上所述。抗血管生成劑應(yīng)該隨意可得，以提供快速直接的活性，也可以持續(xù)釋放形式存在，如與延長活性的運(yùn)送系統(tǒng)相結(jié)合。這種系統(tǒng)亦在美國專利No.5,853,746中有所描述。
或者，在植入滑膜組織，細(xì)胞或基質(zhì)前，面朝骨組織放置一層膜，防止血管和血管周圍的細(xì)胞從在下面的骨髓空隙或其它周圍組織向內(nèi)生長，從而防止在缺損部位形成骨組織。參見美國專利No.5,270,300和5,853,746。還可在控釋運(yùn)送系統(tǒng)內(nèi)加入抗炎劑，以防止炎癥細(xì)胞的污染。
在以上包括體外細(xì)胞培養(yǎng)或者滑膜組織或細(xì)胞原位轉(zhuǎn)化的具體實(shí)施方式
中，可用一個或多個生軟骨基因穩(wěn)定地或瞬時地轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞。如果是體外細(xì)胞培養(yǎng)，可在植入到缺損之前，在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中進(jìn)行該操作。如果是原位轉(zhuǎn)化，可以用本領(lǐng)域公知的方法，如脂質(zhì)體或腺病毒載體，也在原位進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
一個涉及轉(zhuǎn)染的生軟骨基因的具體實(shí)施方式
是缺損處應(yīng)用了層疊的滑膜組織，該層疊組織間隔插有選擇的轉(zhuǎn)染載體，這樣可實(shí)現(xiàn)原位轉(zhuǎn)染。生軟骨基因的例子包括但不限于BMP，BMP-2，BMP-9，TGF-β，CDMP，IHH，SHH和SOX-9，并可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，如電穿孔，脂質(zhì)體運(yùn)送和病毒載體，可視情況而定。本領(lǐng)域公知的生軟骨基因的編碼DNA可使用從已公開的待轉(zhuǎn)染生軟骨基因的DNA序列所獲得的引物序列，通過PCR擴(kuò)增市售DNA文庫而獲得。
在以上的每個具體實(shí)施方式
中，組織或基質(zhì)可能在修復(fù)組織區(qū)域非特異性地礦化或鈣化。因此可向組織或基質(zhì)中加入鈣化或礦化抑制劑如雙膦酸酯類，以防止這種不期望的礦化或鈣化，保持修復(fù)組織的透明樣特點(diǎn)。還期望抑制軟骨細(xì)胞分化為肥大軟骨細(xì)胞，該細(xì)胞會使組織修復(fù)區(qū)域礦化?？墒褂眉谞钆韵偌に厥荏w蛋白或其它已知的活性劑來完成該抑制。
在前述的每一具體實(shí)施方式
中，在植入滑膜組織或細(xì)胞，以及任選地用生物可降解覆蓋膜覆蓋被填充的缺損處之后，分層次地手術(shù)關(guān)閉關(guān)節(jié)間隙。
本發(fā)明方法可以治療動物，包括人類的軟骨缺損，該方法操作簡單，并僅限于患病關(guān)節(jié)區(qū)域。整個治療可以通過關(guān)節(jié)鏡，開放性手術(shù)或經(jīng)皮操作來完成。
為更好地理解本發(fā)明，提供下述實(shí)施例。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例是用于舉例說明本發(fā)明的目的，而不是以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1.使用滑膜在體內(nèi)覆蓋關(guān)節(jié)軟骨缺損為測試用滑膜覆蓋關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果，利用刨工工具在成熟山羊體內(nèi)形成5mm寬，10mm長，0.7mm深的缺損。用纖維蛋白基質(zhì)填充新缺損，該基質(zhì)含有40ng/ml游離增殖劑(IGF-1)和1.0μg/ml脂質(zhì)體包封的轉(zhuǎn)化生長因子(BMP-2)。然后用從關(guān)節(jié)壁切出的相同尺寸的滑膜覆蓋缺損，并用vycril7.0縫合材料通過采用簡單間斷縫合，將其與缺損邊緣縫合到一起。關(guān)閉關(guān)節(jié)后，將動物關(guān)節(jié)保持固定在軟模中超過4周(n＝6只動物)。實(shí)行安樂死，并進(jìn)行組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)滑膜已很好地并入周圍軟骨組織邊界中，還已轉(zhuǎn)化為軟骨樣組織。在其中的三只動物中，滑膜組織的取向?yàn)榛ひr細(xì)胞朝向關(guān)節(jié)腔，而在另外三只中，襯細(xì)胞朝向缺損空隙。這兩組都獲得了類似的結(jié)果(即覆蓋膜的朝向在本發(fā)明方法中似乎無關(guān)緊要)。
實(shí)施例II.A.使用滑膜碎塊在體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損在較大的關(guān)節(jié)軟骨缺損中，滑膜細(xì)胞從滑膜向關(guān)節(jié)軟骨缺損處遷移以使可轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞以修復(fù)軟骨的細(xì)胞占據(jù)缺損的過程可能太慢，或者提供的細(xì)胞數(shù)目不足以在術(shù)后最初幾周內(nèi)通過細(xì)胞增殖和組織分化而實(shí)現(xiàn)完全填充缺損。為提供更多細(xì)胞來源數(shù)目用于修復(fù)，可將滑膜材料切割成小組織碎塊，并與纖維蛋白基質(zhì)混合，再與轉(zhuǎn)化因子一起置于缺損處。然后用滑膜覆蓋膜覆蓋缺損，如以上實(shí)施例I所述。除了向纖維蛋白基質(zhì)中加入滑膜小碎塊之外，該試驗(yàn)全部如上所述。處死動物后，存在大量組織轉(zhuǎn)化區(qū)域，修復(fù)細(xì)胞的數(shù)目足以形成新的軟骨組織。
實(shí)施例II.B.移植前部分滅活滑膜組織修改實(shí)施例II.A.(上述)將移植的滑膜覆蓋膜單次冷凍并立即解凍。也同樣處理滑膜組織小碎塊，以減少滑膜組織中存在的巨噬細(xì)胞的數(shù)目。加入該步驟，可獲得更加均相的軟骨組織轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例III.使用層疊的滑膜在體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損實(shí)施例I(以上)所述的實(shí)驗(yàn)按如下改變用尺寸約為缺損本身大小的滑膜層疊物填充缺損。在置入缺損之前，將每層滑膜都浸入4.4mg/ml的BMP-2溶液，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為軟骨組織。另外，在滑膜層之間，沉積少量的含轉(zhuǎn)化因子(BMP-2，4.4mg/ml)的纖維蛋白基質(zhì)或微球，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化因子控釋。肉眼可見滑膜組織已轉(zhuǎn)化為軟骨樣組織。
實(shí)施例IV.使用培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞在體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損類似實(shí)施例I(以上)所述的缺損治療可如下進(jìn)行進(jìn)行外科手術(shù)干預(yù)，取出適量的滑膜和/或滑液，優(yōu)選取自待修復(fù)的關(guān)節(jié)，然后將獲得的滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng)，直到濃度達(dá)到10000-300000細(xì)胞/毫升溶液?？墒褂迷鲋硠┘铀倥囵B(yǎng)滑膜細(xì)胞群的擴(kuò)增。
然后將培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞群懸液直接植入到缺損部位。局部麻醉下，進(jìn)行小關(guān)節(jié)鏡或手術(shù)干預(yù)。使用無菌的吸收巾，沾吸干燥缺損表面，然后用滅菌的蛋白聚糖降解酶溶液填充缺損空腔，處理2-10分鐘，使軟骨表面以及距缺損表面約1-2μm深處局部的蛋白聚糖降解。然后去除蛋白聚糖降解酶，清洗缺損處。
然后將懸液或基質(zhì)(優(yōu)選濃度為10000-300000細(xì)胞/毫升溶液或基質(zhì))中的培養(yǎng)滑膜細(xì)胞植入到缺損處，優(yōu)選與轉(zhuǎn)化因子相結(jié)合，如TGF-β，以促進(jìn)滑膜細(xì)胞分化為產(chǎn)生軟骨的軟骨細(xì)胞。為防止植入細(xì)胞丟失到關(guān)節(jié)間隙，用一薄層生物可降解覆蓋膜覆蓋缺損部位表面，優(yōu)選用滑膜。用縫合線，纖維蛋白膠，組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等將覆蓋膜與缺損部位邊緣封住。如果使用縫合線連接滑膜覆蓋膜，可將縫合線用適當(dāng)濃度的轉(zhuǎn)化因子如BMP-2浸透，以促進(jìn)覆蓋膜中的滑膜分化為軟骨細(xì)胞。
植入培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞以及覆蓋生物可降解覆蓋膜后，有層次地手術(shù)關(guān)閉關(guān)節(jié)腔。
實(shí)施例V.滑膜組織的原位轉(zhuǎn)化檢查成年兔子中滑膜組織在BMP-2作用下的原位轉(zhuǎn)化過程。研究共設(shè)五組，每組五只兔子。將含有100ng/ml負(fù)載BMP-2的脂質(zhì)體的膠原基質(zhì)縫合至每只動物膝關(guān)節(jié)的滑膜。植入膠原基質(zhì)后，有層次地手術(shù)關(guān)閉關(guān)節(jié)腔。
在第0，6，8，12和14天進(jìn)行關(guān)節(jié)的組織學(xué)檢查。固定整個關(guān)節(jié)，并包埋在塑料中，然后制備1.5mm的連續(xù)切片。以這種方法可以觀察到組織構(gòu)成隨時間而發(fā)生的改變?？煞直娉鏊姆N組織類型(1)正?；そM織；(2)新的結(jié)締組織；(3)新軟骨；和(4)新骨(具有骨髓)。
在第6天，只觀察到正常的滑膜組織和新的結(jié)締組織。第8天出現(xiàn)了軟骨灶。第10天，新的軟骨形成更多。第12天，出現(xiàn)骨灶，第14天，除了軟骨外，可以見到相當(dāng)量的骨。這些結(jié)果說明膝關(guān)節(jié)中的滑膜組織含有成熟干細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下，其能夠轉(zhuǎn)化為軟骨和骨。
權(quán)利要求
1.治療包括人在內(nèi)的動物中關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法，該方法包括從動物中取出一部分滑膜組織；并用該滑膜組織填充軟骨缺損。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述滑膜組織與生物可降解基質(zhì)混合，將這兩種材料都植入缺損。
3.治療包括人在內(nèi)的動物中關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法，該方法包括從動物中取出滑膜組織片；向滑膜組織片加入有效量的轉(zhuǎn)化因子；并用該轉(zhuǎn)化因子和滑膜組織片填充軟骨缺損，所述轉(zhuǎn)化因子能夠使滑膜組織中的滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的方法，其中轉(zhuǎn)化因子選自TGF-β，BMP，CDMP，IHH，SHH和SOX-9。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括以下步驟用一個或多個生軟骨基因轉(zhuǎn)染滑膜組織中存在的細(xì)胞，所述基因選自BMP，BMP-2，BMP-9，TGF-β，CDMP，IHH，SHH和SOX-9，其中所述轉(zhuǎn)染會導(dǎo)致產(chǎn)生一種或多種能實(shí)現(xiàn)滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化因子。
6.權(quán)利要求3的方法，其中轉(zhuǎn)化因子是與控釋運(yùn)送系統(tǒng)相結(jié)合。
7.權(quán)利要求6的方法，其中控釋運(yùn)送系統(tǒng)選自脂質(zhì)體，微球，生物可侵蝕聚合物，與硫酸肝素蛋白聚糖化學(xué)相連的膠原纖維，以及基于碳水化合物的微粒。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中使用滑膜覆蓋膜覆蓋缺損。
9.權(quán)利要求8的方法，其中滑膜覆蓋膜在使用前被部分滅活。
10.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括用礦化抑制劑處理缺損部位。
11.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括用鈣化抑制劑處理缺損部位。
12.治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的組合物，含有生物可降解基質(zhì)或基質(zhì)-形成材料；滑膜組織片制備物；和有效量的轉(zhuǎn)化因子以使滑膜組織中的滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中轉(zhuǎn)化因子選自TGF-β，BMP，CDMP，IHH，SHH和SOX-9。
14.權(quán)利要求12的組合物，進(jìn)一步含有有效量的增殖劑，以刺激滑膜細(xì)胞的增殖。
15.權(quán)利要求12的組合物，進(jìn)一步含有有效量的抗血管生成劑，以防止在軟骨缺損處血管向內(nèi)生長和形成骨組織。
16.權(quán)利要求12的組合物，進(jìn)一步含有有效量的礦化抑制劑。
17.權(quán)利要求12的組合物，進(jìn)一步含有有效量的鈣化抑制劑。
18.治療包括人在內(nèi)的動物中軟骨缺損的方法，該方法包括將浸透了轉(zhuǎn)化因子的墊靠近動物滑膜放置，使得滑膜內(nèi)的滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞；以及用所獲的含軟骨細(xì)胞的組織填充軟骨缺損。
19.權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的組合物，進(jìn)一步含有纖維蛋白膠，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或纖連蛋白，以增強(qiáng)基質(zhì)對缺損部位的粘附。
20.治療包括人在內(nèi)的動物中關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法，該方法包括用治療性制劑填充缺損以修復(fù)缺損，并用滑膜覆蓋膜覆蓋缺損。
21.權(quán)利要求20的方法，其中滑膜覆蓋膜是自體的。
22.權(quán)利要求20的方法，其中滑膜覆蓋膜是異體的。
23.權(quán)利要求20的方法，其中滑膜覆蓋膜上帶有有效量的轉(zhuǎn)化因子，以促進(jìn)滑膜覆蓋膜中的滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。
24.權(quán)利要求20-23任一項(xiàng)的方法，其中滑膜覆蓋膜在使用前被部分滅活。
25.權(quán)利要求23的方法，其中轉(zhuǎn)化因子選自TGF-β，BMP，CDMP，IHH，SHH和SOX-9。
26.治療軟骨缺損的組合物，其含有滑膜覆蓋膜。
27.權(quán)利要求26的組合物，進(jìn)一步含有有效量的轉(zhuǎn)化因子以促進(jìn)滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27的方法，其中轉(zhuǎn)化因子選自TGF-β，BMP，CDMP，IHH，SHH和SOX-9。
29.權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的組合物，其中滑膜覆蓋膜在使用前被部分滅活。
30.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)或權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括用一種物質(zhì)處理缺損，以降解缺損表面的蛋白聚糖，并在填充缺損的步驟之前除去該物質(zhì)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中降解蛋白聚糖的物質(zhì)是軟骨素酶AC。
32.權(quán)利要求2的方法，其中基質(zhì)選自纖維蛋白，膠原，明膠，瓊脂糖及其組合。
33.權(quán)利要求8或20的方法，其中使用浸透了轉(zhuǎn)化因子的縫合線將覆蓋膜連到缺損邊緣。
34.治療包括人在內(nèi)的動物中關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法，該方法包括用自體滑膜組織填充缺損，并用自體滑膜覆蓋膜覆蓋缺損。
35.權(quán)利要求34的方法，其中自體滑膜上帶有有效量的轉(zhuǎn)化因子，以促進(jìn)滑膜中的滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。
36.一種固定放置于關(guān)節(jié)軟骨缺損內(nèi)的細(xì)胞或組織的方法，包括在缺損的底部在多個位點(diǎn)穿透軟骨下骨板；用膜覆蓋缺損底部；在缺損底部和膜之間沉積生骨因子和/或生血管因子；在膜之上和介于膜與關(guān)節(jié)缺損頂部平面之間，沉積生軟骨制劑，該制劑選自細(xì)胞懸液，容納在基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞，滑膜組織和容納在基質(zhì)內(nèi)的滑膜組織；并用覆蓋膜覆蓋缺損。
37.權(quán)利要求36的方法，進(jìn)一步包括在膜和覆蓋膜之間放置轉(zhuǎn)化因子。
38.權(quán)利要求36的方法，進(jìn)一步包括在膜和覆蓋膜之間放置抗血管生成因子。
39.權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)的方法，其中膜和覆蓋膜包括滑膜。
40.權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)化因子選自TGF-β，BMP，CDMP，IHH，SHH和SOX-9。
41.治療包括人在內(nèi)的動物中關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法，該方法包括從該動物中取出一部分滑膜；從取出的滑膜中得到滑膜細(xì)胞；體外培養(yǎng)并增殖滑膜細(xì)胞；以及用該培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞填充軟骨缺損。
42.治療包括人在內(nèi)的動物中關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法，該方法包括從該動物中取出一部分滑膜；從取出的滑膜中得到滑膜細(xì)胞；體外培養(yǎng)并增殖滑膜細(xì)胞；將該培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞植入到生物可降解基質(zhì)中；以及用該含有培養(yǎng)滑膜細(xì)胞的基質(zhì)填充軟骨缺損。
43.權(quán)利要求41或42的方法，其中還使用有效量的轉(zhuǎn)化因子填充軟骨缺損。
44.治療包括人在內(nèi)的動物中關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法，該方法包括從該動物中取出一部分滑膜；從取出的滑膜中得到單個的滑膜細(xì)胞；體外培養(yǎng)并增殖滑膜細(xì)胞；用轉(zhuǎn)化因子刺激滑膜細(xì)胞以誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞；以及用該軟骨細(xì)胞懸液填充軟骨缺損。
45.治療包括人在內(nèi)的動物中關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法，該方法包括從該動物中取出一部分滑膜；從取出的滑膜中得到滑膜細(xì)胞；體外培養(yǎng)并增殖滑膜細(xì)胞；用轉(zhuǎn)化因子刺激滑膜細(xì)胞以誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞；將該軟骨細(xì)胞植入到生物可降解基質(zhì)中；以及用該含有軟骨細(xì)胞的基質(zhì)填充軟骨缺損。
46.權(quán)利要求41，42，44或45任一項(xiàng)的方法，其中還使用有效量的抗血管生成劑填充軟骨缺損，以防止血管組織向內(nèi)生成和形成骨組織。
47.治療包括人在內(nèi)的動物中關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法，該方法包括從該動物中取出一部分滑膜；從取出的滑膜中得到單個的滑膜細(xì)胞；體外培養(yǎng)并增殖滑膜細(xì)胞；用轉(zhuǎn)化因子刺激滑膜細(xì)胞以誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞；刺激軟骨細(xì)胞在體外產(chǎn)生軟骨基質(zhì)；以及用所得的由軟骨細(xì)胞及其周圍的軟骨基質(zhì)組成的軟骨組織填充軟骨缺損。
48.權(quán)利要求47的方法，進(jìn)一步包括以下步驟在填充軟骨缺損前，令產(chǎn)生的軟骨基質(zhì)經(jīng)受部分酶促消化作用以釋放形成軟骨基質(zhì)的軟骨細(xì)胞。
49.權(quán)利要求41，42，44，45，47或48任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括用物質(zhì)處理缺損部位，以降解缺損表面的蛋白聚糖，并在填充缺損的步驟之前除去該物質(zhì)。
50.權(quán)利要求49的方法，其中降解蛋白聚糖的物質(zhì)是軟骨素酶AC。
51.權(quán)利要求42，44或45任一項(xiàng)的方法，其中基質(zhì)選自纖維蛋白，膠原，明膠，瓊脂糖及其組合。
52.權(quán)利要求46的方法，其中抗血管生成劑選自蘇拉明，制管張素，金屬蛋白酶抑制劑，抗-bFGF抗體，抗-ESAF抗體，煙曲霉素，和AGM-1470。
53.權(quán)利要求44，45，47或48任一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)化因子選自TGF-β，BMP，CDMP，IHH，SHH和SOX-9。
54.權(quán)利要求47的方法，進(jìn)一步包括以下步驟在將軟骨植入到缺損部位之前，修飾在體外產(chǎn)生的軟骨的大小和形狀以適合缺損部位。
55.治療軟骨缺損的組合物，含有生物可降解基質(zhì)或基質(zhì)-形成材料；滑膜細(xì)胞制品；和有效量的轉(zhuǎn)化因子以轉(zhuǎn)化滑膜細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。
56.權(quán)利要求55的組合物，進(jìn)一步含有有效量的增殖劑，以刺激滑膜細(xì)胞的增殖。
57.權(quán)利要求55的組合物，進(jìn)一步含有有效量的抗血管生成劑，以防止血管向內(nèi)生長入軟骨中。
58.權(quán)利要求55的組合物，其中轉(zhuǎn)化因子與控釋運(yùn)送系統(tǒng)相結(jié)合。
59.權(quán)利要求41，42，44，45，47，48或54任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括用覆蓋膜覆蓋被填充的缺損，以防止填充缺損的細(xì)胞丟失。
60.權(quán)利要求59的方法，其中覆蓋膜是滑膜覆蓋膜。
61.權(quán)利要求41，42，44，45，47或48任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括用礦化抑制劑處理缺損部位。
62.權(quán)利要求55的組合物，進(jìn)一步含有礦化抑制劑。
63.權(quán)利要求41，42，44，45，47或48任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括用鈣化抑制劑處理缺損部位。
64.權(quán)利要求55的組合物，進(jìn)一步含有鈣化抑制劑。
65.權(quán)利要求42，45，47或48任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括用纖維蛋白膠或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和/或纖連蛋白處理缺損部位，以增強(qiáng)基質(zhì)對缺損部位的粘附。
66.權(quán)利要求55的組合物，進(jìn)一步含有纖維蛋白膠或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和/或纖連蛋白，以增強(qiáng)基質(zhì)對缺損部位的粘附。
67.權(quán)利要求42，44，45，47或48任一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)化因子與控釋運(yùn)送系統(tǒng)相結(jié)合。
68.權(quán)利要求62的方法，其中使用浸透了轉(zhuǎn)化因子的縫合線將覆蓋膜與缺損邊緣相連。
全文摘要
本發(fā)明提供治療動物和人類軟骨缺損的組合物和方法。本發(fā)明組合物含有滑膜組織，滑膜細(xì)胞和含滑膜(或形成層)組織或細(xì)胞的基質(zhì)，用于填充軟骨缺損。該基質(zhì)和滑膜組織或細(xì)胞制品還可含有增殖劑，轉(zhuǎn)化因子或其它活性物質(zhì)，以促進(jìn)愈合?？墒褂每蒯屵\(yùn)送系統(tǒng)來施用轉(zhuǎn)化因子。本發(fā)明組合物還含有滑膜覆蓋膜或滅活的筋膜層用于覆蓋軟骨缺損。在本發(fā)明的方法中，進(jìn)行侵入性極小的外科手術(shù)干預(yù)從關(guān)節(jié)中取出一小部分滑膜。將部分滑膜或體外擴(kuò)增的細(xì)胞，單獨(dú)或與基質(zhì)一起植入到缺損部位中，在那里產(chǎn)生新的軟骨組織，修復(fù)缺損。或者，可在原位形成部分轉(zhuǎn)化的滑膜衍生組織，并植入到缺損部位。
文檔編號A61L27/38GK1498266SQ02805230
公開日2004年5月19日 申請日期2002年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月30日
發(fā)明者E·B·亨奇克, E B 亨奇克 申請人:原基因公司