專利名稱：一種雞亞單位四聯(lián)疫苗及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于禽類疫苗制造領(lǐng)域，具體涉及一種雞亞單位四聯(lián)疫苗及其制備和應(yīng)用，即一種雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感-傳染性法氏囊病四聯(lián)疫苗。
背景技術(shù)：
雞新城疫(newcastle disease，ND)是由雞新城疫病毒(NDV)引起的禽類急性傳染病，傳播速度快，長(zhǎng)期以來(lái)給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的威脅。雞新城疫活疫苗雖然效果好、價(jià)格低廉、使用方便，但其免疫期短、免疫易受母源抗體干擾，且容易引起呼吸道副作用，干擾實(shí)驗(yàn)室診斷病毒分離，因此，1980年以來(lái)，使用雞新城疫滅活疫苗逐漸成為我國(guó)雞場(chǎng)防治雞新城疫的常規(guī)方法之一。雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)又稱雞傳染性腔上囊病， 是由傳染性法氏囊病毒引起的一種急性、接觸傳染性疾病。以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重受損為特征，能夠引起雞的免疫機(jī)能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。該病發(fā)病率高，是目前養(yǎng)禽業(yè)最重要的疾病之一。而且，近年來(lái)由于超強(qiáng)毒的出現(xiàn)，傳統(tǒng)的疫苗免疫失敗屢屢發(fā)生，因此，有必要篩選雞傳染性法氏囊病毒的不同等位基因，并借助基因工程亞單位疫苗的方法為雞傳染性法氏囊病預(yù)防提供了一條新的途徑。雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis, IB)是急性接觸性傳染性呼吸道疾病，其特征為病雞咳嗽、噴嚏、氣管啰音，蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降。IB為世界各國(guó)集約化養(yǎng)雞普遍存在的疫病，有的地區(qū)陽(yáng)性率可達(dá)100%。我國(guó)主要流行的病原血清型是Massachusetts型，該型毒株異型毒株也能產(chǎn)生較好的免疫力，我國(guó)普遍選用M41株做為疫苗毒株。禽流感(avian influenza, Al)是由A型禽流行性感冒病毒引起的一種禽類傳染病。禽流感病毒感染后可以表現(xiàn)為輕度的呼吸道癥狀、消化道癥狀，死亡率較低；或表現(xiàn)為較嚴(yán)重的全身性、出血性、敗血性癥狀，死亡率較高。這種癥狀上的不同，主要是由禽流感的毒型決定的。本發(fā)明所采用的H9亞型毒株制備的疫苗能預(yù)防血清型為H9亞型的禽流感病毒感染。為了有效控制ND、IB、Al和IBD，減少接種次數(shù)，便于生產(chǎn)應(yīng)用，因此，有必要提供一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感和傳染性法氏囊病四聯(lián)疫苗來(lái)滿足市場(chǎng)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備一種可以同時(shí)預(yù)防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、禽流感和雞傳染性法氏囊病特別是超強(qiáng)毒感染的疫苗，其中的雞傳染性法氏囊病部分是采用大腸桿菌表達(dá)的主要抗原保護(hù)性蛋白VP2蛋白制成的亞單位疫苗。本發(fā)明的四聯(lián)疫苗，包含有序列為SEQ ID NO 1的雞傳染性法氏囊病VP2蛋白和新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒。上述的四聯(lián)疫苗的制備方法，是將新城疫病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；將雞傳染性支氣管炎病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；將禽流感病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；然后將滅活的新城疫病毒胚液、雞傳染性支氣管炎病毒胚液、禽流感病毒胚液與雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白混合后，加入疫苗佐劑乳化制成的。上述的新城疫病毒為新城疫病毒Clone30。上述的傳染性支氣管炎為傳染性支氣管炎M41。上述的禽流感病毒為H9亞型NJ02株。本發(fā)明四聯(lián)疫苗免疫21日齡的雞，可同時(shí)預(yù)防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、禽流感和雞傳染性法氏囊病，免疫效果與雞新城疫單苗、雞傳染性支氣管炎滅活疫苗、禽流感及雞傳染性法氏囊病單苗效果相似，達(dá)到了減少免疫次數(shù)，降低應(yīng)激的目的。
具體實(shí)施方式

IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2蛋白是最主要宿主保護(hù)性抗原，本發(fā)明是用PCR方法擴(kuò)增了 IBD超強(qiáng)毒的VP2基因，克隆到pET-28a載體上，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后VP2蛋白獲得了表達(dá)，將表達(dá)菌體高壓勻漿破碎后離心取上清即為VP2蛋白溶液。新城疫病毒Clone30株接種10日齡SPF胚，收取培養(yǎng)48 96小時(shí)的雞胚液，超濾濃縮法將病毒液濃縮，加入終濃度為O. 1%的甲醛。雞傳染性支氣管炎病毒M42株接種l(Tll日齡SPF胚，收取培養(yǎng)24 48小時(shí)的雞胚液，超濾濃縮法將病毒濃縮，加入終濃度為O. 1%的甲醛。將VP2蛋白液與新城疫病毒液、雞傳染性支氣管炎病毒液、禽流感病毒液混合后乳化配苗。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感-傳染性法氏囊病毒VP2亞單位四聯(lián)疫苗進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、新城疫病毒液的制備將新城疫病毒Clone30株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，用滅菌生理鹽水做適當(dāng)稀釋，經(jīng)尿囊腔接種擴(kuò)10日齡易感雞胚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，直36 37°C繼續(xù)孵育。棄去48小時(shí)前死亡雞胚，此后Γ8小時(shí)照蛋一次，死亡胚隨時(shí)取出，直至96小時(shí)全部取出，置疒8°C冷卻12 24小時(shí)。收獲雞胚尿囊液及羊水，棄去血凝價(jià)低于1:128，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。新城疫病毒液的濃縮將收獲的病毒液用二級(jí)預(yù)過(guò)濾柱除去大顆粒雜質(zhì)，然后用病毒超濾法濃縮系統(tǒng)將新城疫病毒液濃縮至原體積的1/4。滅活將濃縮后的病毒液置于滅活罐內(nèi)，加入終濃度為O. 1%的甲醛，隨加隨攪拌，使其充分混合。37°C滅活16小時(shí)。二、雞傳染性支氣管炎病毒液的制備將雞傳染性支氣管炎病毒M41株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)用滅菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，經(jīng)尿囊腔接種l(Tll日齡易感雞胚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育。棄去24小時(shí)前死亡雞胚，此后4飛小時(shí)照蛋一次，死亡胚隨時(shí)取出，直至48小時(shí)全部取出，置2 8°C冷卻12 24小時(shí)。收獲雞胚尿囊液及羊水。雞傳染性支氣管炎病毒液的濃縮
將收獲的病毒液用二級(jí)預(yù)過(guò)濾柱除去大顆粒雜質(zhì)，然后用病毒超濾法濃縮系統(tǒng)將新城疫病毒液濃縮至原體積的1/4。滅活將濃縮后的病毒液置于滅活罐內(nèi)，加入終濃度為O. 1%的甲醛，隨加隨攪拌，使其充分混合。37°C滅活16小時(shí)。三、禽流感病毒液的制備將禽流感種毒NJ02用滅菌用生理鹽水做適當(dāng)稀釋，每胚尿囊腔內(nèi)接種O.1ml，密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，棄去24小時(shí)以內(nèi)死亡的雞胚，24小時(shí)后4飛小時(shí)照蛋一次，隨時(shí)取出死胚，直至120小時(shí)全部取出，置2 8°C冷卻12 24小時(shí)。收獲雞胚尿囊液及羊水。禽流感病毒的濃縮 將收獲的病毒液用二級(jí)預(yù)過(guò)濾柱除去大顆粒雜質(zhì)，然后用病毒超濾法濃縮系統(tǒng)將禽流感病毒液濃縮至原體積的1/4。滅活將濃縮后的病毒液置于滅活罐內(nèi)，加入終濃度為O. 1%的甲醛，隨加隨攪拌，使其充分混合。37°C滅活16小時(shí)。四、VP2基因的篩選用Primer5. O軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增雞傳染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保護(hù)性堿基及BamH I酶切位點(diǎn)，在下游引物的5'端加入保護(hù)性堿基和Xho I酶切位點(diǎn)，引物序列為Primer I 5/ -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'Primer 2 5/ -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'取200 μ 用臨床分離的疑似IBDV的病料感染的雞胚接種尿囊膜懸液上清液，按RNAisoReagent說(shuō)明書所述方法提取病毒RNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為(50 μ ):10XPCR Buffer δμΙ, ΝΤΡ (IOmM each) μ ,上、下游引物(IOmM)各 μ ，cDNA 3 μ , 25mM MgCl2 4 μ , Taq酶(5υ/μ1 ) μ1，(ΗΗ2034μ1 ;PCR 反應(yīng)參數(shù)95 °C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)，72 °CIOmin。得到一個(gè)1300bp左右的片段，切膠回收該片段，與pMD-18T載體連接。PCR回收片段 6μ1，Τ 載體 2μ1 (稀釋 10 倍后)，T4 DNA 連接酶 μ1，Τ4 buffer 2. 5μ1，水13. 5μ1，總計(jì)25μ1。16°C過(guò)夜連接，取20 μ 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，挑選10個(gè)白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒鑒定正確的選取3個(gè)測(cè)序，結(jié)果3個(gè)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果都一致，證明獲得的核苷酸片段在擴(kuò)增的過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生錯(cuò)誤，其核苷酸序列為SEQ ID Ν0:2，翻譯的氨基酸序列為 SEQ ID NO:1。將該核苷酸序列在NCBI上Blast比對(duì)，有十幾個(gè)堿基發(fā)生了點(diǎn)突變，表明該毒株為一株新的流行毒株。這是由于VP2蛋白是主要宿主保護(hù)性抗原，經(jīng)常發(fā)生突變而導(dǎo)致抗原性發(fā)生差異。VP2重組蛋白的表達(dá)將鑒定正確的上述一個(gè)質(zhì)粒用BamH I和Xho I雙酶切回收基因片段，與用這兩個(gè)酶切的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒鑒定正確后轉(zhuǎn)化感受體的BL21 (DE3)，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接5mlLB小管培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)3 4小時(shí)至0D600為O. 6時(shí)，加入終濃度為O. 8mM的IPTG誘導(dǎo)4飛小時(shí)，SDS-PAGE電泳結(jié)果證實(shí)為分泌表達(dá)。將表達(dá)菌用5倍菌體濕重PBS重懸，高壓勻漿破碎細(xì)菌，離心取上清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果瓊擴(kuò)效價(jià)不低于1:64。VP2蛋白的純化用鎳柱純化，200mM的咪唑洗脫，洗脫液用PBS透析過(guò)夜。所得透析液即為純化的蛋白，可用于制苗。VP2亞單位疫苗的制備取注射用白油94份、司本-80 6份，混合后加入硬脂酸鋁2份加熱溶化，116°C滅菌30分鐘，做為制苗用油相；加入滅菌的吐溫-80 4份，然后加入上述制備的VP2重組蛋白 發(fā)酵提取液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解，做為制苗用水相；取油相3份放于膠體磨內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為O. 01 %。VP2亞單位疫苗的免疫效果將20只SPF雞隨機(jī)分為兩組，每組10只，其中一組在21日齡時(shí)以O(shè). 3ml/只的劑量皮下注射VP2亞單位疫苗，免疫21日后連同不免疫對(duì)照組每只經(jīng)點(diǎn)眼途徑接種100BID雞傳染性法氏囊病強(qiáng)毒BC6-85株毒液，攻毒后每天觀察雞只的臨床表現(xiàn)及死亡情況，記錄發(fā)病和死亡雞數(shù)，剖檢觀察死亡雞法氏囊等病變，72 96小時(shí)撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病理變化。結(jié)果不免疫對(duì)照組8只雞發(fā)病，而免疫組雞只無(wú)發(fā)病。上述結(jié)果證明本發(fā)明制備的VP2亞單位疫苗具有很好的免疫原性。五、四聯(lián)疫苗的制備取注射用白油94份、司本-80 6份混合后加入硬脂酸鋁2份，加熱溶化，116°C滅菌30分鐘做為制苗用油相；將上述制備的滅活新城疫病毒液、滅活的傳支病毒液、禽流管病毒液和VP2重組蛋白發(fā)酵提取液按照1:1:1:2的比例混合均勻制成抗原液；取混和均勻的抗原液96份，再取滅菌的吐溫-80 4份，完全溶解吐溫-80做為制苗用的水相；再取油相3份放于膠體磨內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份，加完后再以IOOOOr/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為O. 01 %，完成四聯(lián)疫苗的制備。對(duì)于四聯(lián)疫苗中滅活新城疫病毒液、滅活的傳支病毒液、滅活的禽流感病毒液和VP2重組蛋白發(fā)酵提取液的比例，本發(fā)明并不做特別的限定，只要制備的四聯(lián)疫苗能夠有效的預(yù)防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、禽流感和雞傳染性法氏囊病即可。四聯(lián)疫苗的使用效果將50只21日齡SPF雞隨機(jī)分為6組，每組10只，其中兩組皮下注射免疫四聯(lián)疫苗O. 3ml，免疫后21日采血分離血清，測(cè)定禽流感HI效價(jià)，取一組免疫雞連同不免疫的對(duì)照用新城疫北京株攻毒，另一組免疫雞連同另一組不免疫的對(duì)照用雞傳染性法氏囊病病毒攻毒，最后一組不攻毒，結(jié)果免疫組20只雞的血清HI抗體效價(jià)的幾何平均數(shù)為1:128，高于規(guī)程規(guī)定的1:90. 5;免疫組中有一只出現(xiàn)輕微的法氏囊癥狀，其余均無(wú)異常；而新城疫攻毒對(duì)照組10/10發(fā)病死亡，雞傳染性法氏囊病病毒攻毒對(duì)照組8/10發(fā)病。將10只21日齡SPF雞個(gè)點(diǎn)眼接種I羽份的雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120)在負(fù)壓隔離器里飼養(yǎng)觀察，另取5只不免疫做對(duì)照。免疫后21日分別采血，分離血清測(cè)HI抗體效價(jià)，同時(shí)肌肉注射四聯(lián)苗O. 5ml。加強(qiáng)免疫后28日分別采血測(cè)HI抗體效價(jià)，結(jié)果二免 的抗體效價(jià)幾何平均數(shù)是首免的3. 6倍，而未免疫對(duì)照組為1:4，表明該四聯(lián)疫苗傳支部分是有效的。
權(quán)利要求
1.一種四聯(lián)疫苗，包含有序列為SEQ ID NO :1的雞傳染性法氏囊病VP2蛋白和新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的四聯(lián)疫苗，其特征在于所述的新城疫病毒為新城疫病毒Clone30o
3.如權(quán)利要求1所述的四聯(lián)疫苗，其特征在于所述的雞傳染性支氣管炎病毒為雞傳染性支氣管炎病毒M41。
4.如權(quán)利要求1所述的四聯(lián)疫苗，其特征在于所述的禽流感病毒為H9亞型NJ02株。
5.權(quán)利要求1所述的四聯(lián)疫苗的制備方法，是將新城疫病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；將傳染性支氣管炎病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；將禽流感病毒接種雞胚后，收獲胚液加入甲醛滅活；然后將新城疫病毒胚液、傳染性支氣管炎病毒胚液、禽流感病毒胚液和雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白混合后，加入疫苗佐劑乳化制成的。
6.權(quán)利要求1所述的四聯(lián)疫苗在預(yù)防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、禽流感和雞傳染性法氏囊病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的目的是制備一種可以同時(shí)預(yù)防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、禽流感和雞傳染性法氏囊病特別是超強(qiáng)毒感染的疫苗，包含有序列為SEQ ID NO1的雞傳染性法氏囊病VP2蛋白和新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和禽流感病毒。本發(fā)明四聯(lián)疫苗免疫21日齡的雞，可同時(shí)預(yù)防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、禽流感和雞傳染性法氏囊病，免疫效果與雞新城疫單苗、雞傳染性支氣管炎滅活疫苗、禽流感滅活疫苗及雞傳染性法氏囊病單苗效果相似，達(dá)到了減少免疫次數(shù)，降低應(yīng)激的目的。
文檔編號(hào)A61K39/145GK103007271SQ20121050663
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者王雷, 凌紅麗, 于春梅, 吳曉燕 申請(qǐng)人:青島康地恩藥業(yè)股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司