專利名稱：牛衣原體病滅活疫苗及其制備與檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治牛傳染病的滅活疫苗的制備方法，以及這種疫苗和制備過程中的相關(guān)檢驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
牛衣原體病是牛的一種傳染性疾病，它對(duì)養(yǎng)牛業(yè)危害最嚴(yán)重的是牛衣原體性流產(chǎn)，該病是由鸚鵡熱衣原體感染牛引起的一種地方流行性的接觸性傳染病，以妊娠母牛流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)或產(chǎn)無活力犢牛為主要特征。該病的同義名有牛流行性流產(chǎn)、牛地方流行性流產(chǎn)、牛新立克次體性流產(chǎn)。由于奶牛衣原體性流產(chǎn)給奶牛場(chǎng)造成的損失不僅僅是胎兒夭折，更嚴(yán)重的是產(chǎn)奶量與正常分娩牛相比，大幅度減產(chǎn)，同時(shí)造成飼料、人力巨大浪費(fèi)和巨額醫(yī)藥費(fèi)開支。國外報(bào)道，一個(gè)平均擁有60頭經(jīng)產(chǎn)奶牛和20頭初產(chǎn)母牛的牧場(chǎng)，每年因衣原體感染引起的產(chǎn)奶量下降、奶質(zhì)量下降、流產(chǎn)和不孕而造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)4萬歐元。目前，我國奶牛存欄1000萬頭左右，最保守按10％的奶牛感染衣原體病，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)4億5千萬歐元(約折合人民幣45億元)。另外，鸚鵡熱衣原體感染人，引起人的鳥疫癥。牛源鸚鵡熱衣原體是否也危害人類健康，也是人們關(guān)注的一個(gè)問題。
早在二十世紀(jì)二十年代，美國人首先報(bào)道了牛地方流行性流產(chǎn)綜合征；到1956年，德國人采用血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，證明原聯(lián)邦德國牛流行性流產(chǎn)是由衣原體感染所致。以后歐洲許多國家，加拿大、前蘇聯(lián)、日本、印度也相繼報(bào)道牛衣原體性流產(chǎn)。中國從八十年代，一些省區(qū)陸續(xù)報(bào)道該病，湖北省(1983)從患地方流行性流產(chǎn)的奶牛群的流產(chǎn)胎犢和乳汁分離出衣原體；用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)檢查6個(gè)牛群衣原體抗體陽性率為10％。1988年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)牦牛衣原體性流產(chǎn)，用CFT檢測(cè)衣原體抗體陽性率為29.03％(45/155)，并從流產(chǎn)胎兒分離到8株鸚鵡熱衣原體。1991年陜西對(duì)西安市6個(gè)奶牛場(chǎng)進(jìn)行衣原體病血清學(xué)調(diào)查，陽性檢出率達(dá)28.31％，并從流產(chǎn)胎兒分離到衣原體。1997-1998年，蘭州獸醫(yī)研究所用用間接血凝試驗(yàn)(IHAT)對(duì)采自山東、河北、河南、陜西、寧夏、甘肅、青海和四川等8個(gè)省區(qū)的肉用牛、肉役兼用黃牛和牦牛血清642份檢測(cè)衣原體抗體，結(jié)果肉用牛平均陽性檢出率為32.6％；肉役兼用黃牛15.2％；牦牛為18.7％。2001年，蘭州獸醫(yī)研究所對(duì)采自廣西、安徽和江蘇12個(gè)縣的343份水牛血清IHAT檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各縣水牛群均程度不同地存在衣原體感染，陽性檢出率最低的為3.3％，最高為39.3％。2002-2004年，陜西和寧夏一些地區(qū)的奶牛場(chǎng)懷孕牛流產(chǎn)問題比較嚴(yán)重，蘭州獸醫(yī)研究所用血清學(xué)和病原學(xué)方法再次證明鸚鵡熱衣原體是引起奶牛流產(chǎn)的重要病原之一。衣原體病對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的危害不可低估。
目前，用四環(huán)素、金霉素等抗生素進(jìn)行牛衣原體病的預(yù)防和治療，費(fèi)用昂貴，由于大量或長期使用抗生素會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生新的抗藥株，使防治效果明顯降低或無效果，病的復(fù)發(fā)率上升。同時(shí)，服藥奶牛體內(nèi)的藥物殘留升高，乳汁中藥物殘留升高，食用抗生素高殘留牛奶或肉將嚴(yán)重危害人民的身體健康。因此，各國都禁止在飼料中添加各類抗生素來防治家畜的細(xì)菌性傳染病，而提倡采用以疫苗免疫為主的綜合性措施防治家畜的細(xì)菌性傳染病。
各國都在進(jìn)行相關(guān)疫苗研究，但是截止今天，沒有見到任何有關(guān)牛衣原體病疫苗研制成功的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種牛衣原體病預(yù)防用滅活疫苗的制備方法，以及這種疫苗和制備過程中的相關(guān)檢驗(yàn)方法。
本發(fā)明的牛衣原體病滅活疫苗的制備方法是將牛源鸚鵡熱衣原體SX5或NX種毒用0.1M pH7.2的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水10000倍稀釋，接種于37℃孵化6～7天的且無鸚鵡熱衣原體感染的健康雞胚，收獲接種72小時(shí)以后死亡雞胚的卵黃膜和尿囊液作為制苗用抗原，將抗原用組織搗碎機(jī)搗碎后過濾，然后將濾液用0.1M pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)20倍稀釋，按稀釋后抗原量的0.2％加入濃度37％的甲醛，容器嚴(yán)格密封好，充分搖均勻，于4℃環(huán)境滅活72小時(shí)，用消毒的206佐劑或11號(hào)食用白油作為佐劑，將滅活抗原與油佐劑按1∶1比例混合、搖均勻，用高壓均質(zhì)機(jī)乳化，得疫苗。
對(duì)于在超低溫冰箱長期保存的牛源鸚鵡熱衣原體SX5或NX制苗菌株(種毒)，在制苗時(shí)可先將菌株接種于無衣原體感染的種雞群所產(chǎn)的經(jīng)37℃孵化的6-7日齡雞胚，傳1-2代進(jìn)行復(fù)蘇，特別是采用2代復(fù)蘇。復(fù)蘇方法是將長期超低溫保存的制苗菌株SX5或NX用滅菌生理鹽水10倍稀釋，接種6-7日齡雞胚，在無菌條件下收取接種第4-6天死亡的雞胚的卵黃膜，將其粉碎后用0.1MpH7.2的磷酸液緩沖液(PBS)或等滲鹽水1000倍稀釋后，再將其按前述的方法接種于二代雞胚上，再在無菌條件下收取接種第4-6天死亡的第二代雞胚的卵黃膜作為制取制苗抗原的種毒。
本發(fā)明所述的牛衣原體病滅活疫苗指前述制備方法所制備的疫苗。
本發(fā)明的牛衣原體病滅活疫苗制備中的檢驗(yàn)方法是a)種子毒檢驗(yàn)將-70℃長期保存的牛源鸚鵡熱衣原體SX5或NX制苗菌株接種無衣原體感染的種雞群所產(chǎn)的37℃孵化的6-7目齡雞胚，傳1-2代，可使全部接種雞胚在接種72小時(shí)以后規(guī)律地死亡，取死亡雞胚的卵黃膜涂片姬姆薩染色鏡檢，只看見大量紫紅色的衣原體原生小體(E)，而沒有任何其他雜菌污染，并且其毒力效價(jià)為10-11-10-13ELD50，此雞胚培養(yǎng)物可以作為繁殖疫苗抗原的種(子)毒。
b)抗原繁殖檢驗(yàn)收獲接種后72小時(shí)死亡雞胚的卵黃膜和尿囊液作為制苗用抗原，其中含有大量的衣原體原生小體，而細(xì)菌檢查為陰性，效價(jià)檢測(cè)≥10-8ELD50為合格；c)抗原滅活檢驗(yàn)抗原滅活72小時(shí)后，無菌抽取樣品，分別接種人工培養(yǎng)基和6-7日齡雞胚培養(yǎng)，人工培養(yǎng)基內(nèi)無任何細(xì)菌生長，雞胚發(fā)育正常無死亡，說明抗原滅活合格，可以用于制苗；d)抗原乳化檢驗(yàn)乳化抗原呈乳白色，不分層。乳化型為水包油包水，滴一滴乳化抗原到水面立刻成圓形，并且云霧狀散開為合格；e)疫苗檢驗(yàn)隨機(jī)取樣，每瓶受檢疫苗分別接種人工培養(yǎng)基和小白鼠，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，試驗(yàn)組5只小鼠接種本疫苗后21天攻毒，從所有小鼠均檢不出衣原體，接種小鼠生長發(fā)育正常，同時(shí)無菌檢驗(yàn)為陰性的為疫苗效檢合格。
本疫苗制備和產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)步驟包括牛源鸚鵡熱衣原體制苗株的抗原雞胚繁殖和收獲；制苗抗原滴度檢測(cè)(≥10-8ELD50)；制苗抗原無菌檢驗(yàn)；制苗抗原的滅活與檢驗(yàn)；滅活抗原的乳化；疫苗分裝；疫苗的無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)。按該步驟在GMP條件下生產(chǎn)出的牛衣原體病滅活疫苗，給適繁牛在配種前或配種后1個(gè)月肌肉或皮下注射5ml/頭可以有效地預(yù)防由鸚鵡熱衣原體感染引起的流產(chǎn)、死產(chǎn)；給犢牛肌肉或皮下注射2ml/頭，可以有效地預(yù)防由鸚鵡熱衣原體感染引起的犢牛肺炎-腸炎，多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，結(jié)膜炎等。本疫苗-一次免疫保護(hù)期達(dá)10個(gè)月以上。大量試驗(yàn)證明該疫苗的安全性良好。
本發(fā)明的有益效果在于1)采用本發(fā)明可制備牛衣原體病滅活疫苗，將其給牛群接種可以有效地預(yù)防各種癥狀的牛衣原體病，可以使免疫牛體內(nèi)產(chǎn)生高水平的衣原體特異性抗體，產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，有效抵抗衣原體感染，相應(yīng)的試驗(yàn)表明，一次接種其保護(hù)期達(dá)可10個(gè)月，可以基本保證妊娠牛能正常分娩和高產(chǎn)泌乳期的到來；并有效保護(hù)犢牛免受衣原體感染。
2)本發(fā)明制苗時(shí)采用先將菌株接種于37℃孵化6～7天的無鸚鵡熱衣原體感染的健康雞胚，傳1-2代進(jìn)行復(fù)蘇，特別是傳2代進(jìn)行復(fù)蘇，再用復(fù)蘇后的菌株為種毒制苗的方法，可以使超低溫冰箱長期保存的牛源鸚鵡熱衣原體SX5或NX菌株毒力復(fù)活，克服直接使用在超低溫長期保藏的牛源鸚鵡熱衣原體SX5或NX菌株制苗，產(chǎn)生的因其分離菌株毒力不夠強(qiáng)，或毒力遺傳性狀不穩(wěn)定，在雞胚或細(xì)胞連續(xù)傳幾代其毒力效價(jià)明顯降低，而降低疫苗的效價(jià)的不足。實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的方法可以使制苗菌株SX5或NX對(duì)6-7日齡SPF雞胚的毒力效價(jià)為10-11-10-13ELD50，雞胚連續(xù)傳代20代以內(nèi)毒力保持不變。
3)本疫苗的應(yīng)用，不必再服用抗生素類化藥預(yù)防衣原體感染，從而使奶牛體內(nèi)藥物殘留大大降低，可以有效保證奶牛源的食品安全，維護(hù)人民飲食的安全。另一方面也可以大大降低牛飼養(yǎng)的成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式
以下提供本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例a)種毒的復(fù)蘇與檢驗(yàn)將-70℃長期保存的牛源鸚鵡熱衣原體SX5或NX制苗菌株接種于無衣原體感染的種雞群所產(chǎn)的37℃孵化的6-7日齡雞胚，傳1-2代，可使全部接種雞胚在接種72小時(shí)以后規(guī)律地死亡，取死亡雞胚的卵黃膜涂片姬姆薩染色鏡檢，只看見大量紫紅色的衣原體原生小體(E)，而沒有任何其他雜菌污染，此雞胚培養(yǎng)物可以作為繁殖疫苗抗原的種(子)毒。
b)抗原繁殖與檢驗(yàn)將衣原體抗體陰性產(chǎn)蛋種雞群所產(chǎn)的種蛋表面清洗消毒后，放入專用孵化機(jī)37℃孵化6-7天，將種毒用0.1M pH7.2的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水10000倍稀釋在無菌環(huán)境里，經(jīng)卵黃囊途徑接種雞胚，接種劑量0.4ml/雞胚。收獲接種后72小時(shí)死亡雞胚的卵黃膜和尿囊液作為制苗用抗原，其中含有大量的衣原體原生小體。細(xì)菌檢查為陰性，效價(jià)檢測(cè)≥10-8ELD50為合格，可用于制苗。
c)抗原滅活與檢驗(yàn)將b)檢驗(yàn)合格的抗原(卵黃膜)用組織搗碎機(jī)搗碎后過濾，然后將濾液用0.1M pH7.2 PBS稀釋20倍，按稀釋后抗原量的0.2％加入濃度37％以上的市售甲醛，充分搖均勻，容器嚴(yán)格密封好，于4℃環(huán)境滅活72小時(shí)，每天要搖容器2-3次，每次振蕩5分鐘?？乖瓬缁?2小時(shí)后，無菌抽取樣品，分別接種人工培養(yǎng)基和6-7日齡雞胚培養(yǎng)，人工培養(yǎng)基內(nèi)無任何細(xì)菌生長，雞胚發(fā)育正常無死亡，說明抗原滅活合格，可以用于制苗。
d)抗原乳化與檢驗(yàn)選用礦物油佐劑(206佐劑或11號(hào)食用白油)高壓消毒。將滅活抗原與油佐劑按1∶1比例混合、搖均勻。用高壓均質(zhì)機(jī)乳化，乳化時(shí)壓力調(diào)到35-40Pa，乳化抗原呈乳白色，乳化型為油包水包油，滴一滴乳化抗原到水面立刻成圓形，并且云霧狀散開。疫苗分裝入疫苗瓶。
e)疫苗檢驗(yàn)按照國家生物制品檢驗(yàn)的規(guī)定，隨即取樣，每瓶受檢疫苗分別接種人工培養(yǎng)基和小白鼠，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)。效力檢驗(yàn)攻毒所用的種毒為原制苗菌株。試驗(yàn)組5只小鼠接種本疫苗后2l天攻毒，從所有小鼠均檢不出衣原體(組織常規(guī)涂片染色檢查或PCR檢查為陰性)；對(duì)照組5只不接種本疫苗，同期攻毒，從所有小鼠均可以檢出衣原體(組織常規(guī)涂片染色檢查或PCR檢查為陽性)。此為疫苗效檢合格。試驗(yàn)組5只小鼠接種本疫苗后生長發(fā)育正常。同時(shí)無菌檢驗(yàn)為陰性。生產(chǎn)的此批疫苗為檢驗(yàn)合格。
本發(fā)明的效力試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1表1 奶牛疫苗效力試驗(yàn)

表l說明用本發(fā)明的3批奶牛衣原體病滅活疫苗(疫苗批號(hào)為040113、040210、040317)分別免疫3組衣原體抗體檢查陰性奶牛，每組3頭，免疫劑量5ml/頭，免疫后2l天攻毒，結(jié)果3個(gè)試驗(yàn)組有l(wèi)頭發(fā)病，其保護(hù)率分別為3/3，2/3，3/3；本次試驗(yàn)的總保護(hù)率為8/9(88.9％)。對(duì)照組2頭奶牛不接種本疫苗，攻毒后2/2發(fā)病，保護(hù)率為0/2。
本發(fā)明用于奶牛進(jìn)行疫苗免疫期試驗(yàn)的數(shù)據(jù)見表2表2奶牛疫苗免疫期試驗(yàn)

表2說明用本發(fā)明的3批奶牛衣原體病滅活疫苗(疫苗批號(hào)為030312、030327、030403)分別免疫3組衣原體抗體檢查陰性奶牛，每組3頭，免疫劑量5ml/頭，免疫后10個(gè)多月攻毒，結(jié)果3個(gè)試驗(yàn)組全保護(hù)，保護(hù)率分別為3/3，3/3，3/3；對(duì)照組2頭奶牛不接種本疫苗，攻毒后2/2發(fā)病，保護(hù)率為0/2。
犢奶牛疫苗免疫安全性試驗(yàn)、懷孕奶牛疫苗免疫安全性試驗(yàn)，以及奶牛田間免疫安全性試驗(yàn)結(jié)果見表3-1、3-2和3-3。
表3-1 犢奶牛疫苗免疫安全性試驗(yàn)(30-40日齡)

表3-2懷孕奶牛疫苗免疫安全性試驗(yàn)(懷孕2個(gè)月左右)

表3-3奶牛田間免疫安全性試驗(yàn)

表3(1-3)說明實(shí)驗(yàn)室3批試驗(yàn)表明本發(fā)明的奶牛衣原體病滅活疫苗對(duì)犢牛、懷孕2個(gè)月左右的成年奶牛均十分安全。田間免疫奶牛5180頭沒有發(fā)生1頭死亡，注射部位和飲食無明顯異常改變，打疫苗后，泌乳量基本正常。
權(quán)利要求
1.牛衣原體病滅活疫苗的制備方法，其特征在于將牛源鸚鵡熱衣原體SX5或NX種毒用0.1M pH7.2的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水10000倍稀釋，接種于37℃孵化6～7天的且無鸚鵡熱衣原體感染的健康雞胚，收獲接種72小時(shí)以后死亡雞胚的卵黃膜和尿囊液作為制苗用抗原，將抗原用組織搗碎機(jī)搗碎后過濾，然后將濾液用0.1M pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)20倍稀釋，按稀釋后抗原量的0.2％加入濃度37％的甲醛，容器嚴(yán)格密封好，充分搖均勻，于4℃環(huán)境滅活72小時(shí)，用消毒的206佐劑或11號(hào)食用白油作為佐劑，將滅活抗原與油佐劑按1∶1比例混合、搖均勻，用高壓均質(zhì)機(jī)乳化，得疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛衣原體病滅活疫苗的制備方法，其特征在于制苗菌株SX5或NX(種毒)，使用時(shí)先接種于37℃孵化6～7天的無鸚鵡熱衣原體感染的健康雞胚，傳1-2代進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇方法是將長期超低溫保存的制苗菌株SX5或NX用滅菌生理鹽水10倍稀釋，接種6-7日齡雞胚，在無菌條件下收取接種第4-6天死亡的雞胚的卵黃膜粉碎后作為第一代種毒，將種毒粉碎后用0.1M pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)或等滲鹽水1000倍稀釋再將其按前述的方法接種于二代雞胚上，再在無菌條件下收取接種第4-6天死亡的第二代雞胚的卵黃膜粉碎后作為制取制苗抗原的種毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牛衣原體病滅活疫苗的制備方法，其特征在于制苗菌株SX5或NX(種毒)，使用時(shí)先接種于37℃孵化6～7天的無鸚鵡熱衣原體感染的健康雞胚，傳2代進(jìn)行復(fù)蘇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的牛衣原體病滅活疫苗的制備方法所制備的疫苗。
5.牛衣原體病滅活疫苗制備中的檢驗(yàn)方法，其特征是a)種子毒檢驗(yàn)將-70℃長期保存的牛源鸚鵡熱衣原體SX5或NX制苗菌株接種無衣原體感染的種雞群所產(chǎn)的37℃孵化的6-7日齡雞胚，傳1-2代，可使全部接種雞胚在接種72小時(shí)以后規(guī)律地死亡，取死亡雞胚的卵黃膜涂片姬姆薩染色鏡檢，只看見大量紫紅色的衣原體原生小體(E)，而沒有任何其他雜菌污染，并且其毒力效價(jià)為10-11-10-13ELD50，此雞胚培養(yǎng)物可以作為繁殖疫苗抗原的種(子)毒。b)抗原繁殖檢驗(yàn)收獲接種后72小時(shí)死亡雞胚的卵黃膜和尿囊液作為制苗用抗原，其中含有大量的衣原體原生小體，而細(xì)菌檢查為陰性，效價(jià)檢測(cè)≥10-8ELD50為合格；c)抗原滅活檢驗(yàn)抗原滅活72小時(shí)后，無菌抽取樣品，分別接種人工培養(yǎng)基和6-7日齡雞胚培養(yǎng)，人工培養(yǎng)基內(nèi)無任何細(xì)菌生長，雞胚發(fā)育正常無死亡，說明抗原滅活合格，可以用于制苗；d)抗原乳化檢驗(yàn)乳化抗原呈乳白色，不分層。乳化型為水包油包水，滴一滴乳化抗原到水面立刻成圓形，并且云霧狀散開為合格；e)疫苗檢驗(yàn)隨機(jī)取樣，每瓶受檢疫苗分別接種人工培養(yǎng)基和小白鼠，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，試驗(yàn)組5只小鼠接種本疫苗后21天攻毒，從所有小鼠均檢不出衣原體，接種小鼠生長發(fā)育正常，同時(shí)無菌檢驗(yàn)為陰性的為疫苗效檢合格。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治牛傳染病的滅活疫苗的制備方法，以及這種疫苗和制備過程中的相關(guān)檢驗(yàn)方法。本發(fā)明的制備方法是將牛源鸚鵡熱衣原體SX5或NX種毒用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水稀釋，接種于37℃孵化6～7天的且無鸚鵡熱農(nóng)原體感染的健康雞胚，收獲接種72小時(shí)以后死亡雞胚的卵黃膜和尿囊液作為制苗用抗原，再將經(jīng)搗碎的抗原用稀釋后加入甲醛滅活，再將滅活抗原與油佐劑按1∶1比例混合、搖均勻，用高壓均質(zhì)機(jī)乳化，得疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/118GK1698892SQ20051004261
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者邱昌慶, 程淑敏, 周繼章, 曹小安, 高雙娣 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所