專(zhuān)利名稱：脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脆弱擬桿菌的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的一類(lèi)疾病，在歐美一些國(guó)家，癌癥的死亡率僅次于心血管系統(tǒng)疾病而居第二位。我國(guó)隨著人口老齡化，腫瘤的發(fā)病率和死亡率都有所增力口，城市居民惡性腫瘤的死亡率已居死因第一位。20世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)保加利亞的長(zhǎng)壽老人比例在同地區(qū)中最高,腫瘤的發(fā)病率也相對(duì)較低。原來(lái),保加利亞人有每天飲用酸奶的習(xí)慣。研究發(fā)現(xiàn)，保加利亞酸奶中含有的益生菌能促進(jìn)胃中失誤殘?jiān)姆纸夂臀?，還能分解乳蛋白，抑制腸胃中致病菌的生長(zhǎng)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明益生菌對(duì)于腫瘤有一定的拮抗作用，并逐漸揭示其作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)益生菌拮抗腫瘤的機(jī)制主要有:優(yōu)化腸道菌群的組合，抑制產(chǎn)生致癌因子的腐敗菌生長(zhǎng)；產(chǎn)生抗誘變物質(zhì)和抗癌物質(zhì)；增強(qiáng)宿主的免疫系統(tǒng)，預(yù)防慢性復(fù)發(fā)性炎癥；結(jié)合蛋白性致突變物質(zhì)和致癌物質(zhì)；影響腫瘤細(xì)胞基因和酶的表達(dá)。結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤之一，據(jù)2012年的統(tǒng)計(jì)資料顯示，全世界每年結(jié)腸癌的新增病例數(shù)高達(dá)120萬(wàn)，每年約有60.87萬(wàn)患者死于結(jié)腸癌。而在我國(guó)，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率也呈不斷上升趨勢(shì)。所以，如何做好結(jié)腸癌的預(yù)防工作以及降低其發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究方向之一。脆弱擬桿菌iBacteroides fragilis)作為一種革蘭氏染色陰性、桿狀、兩端鈍圓而濃染，有莢膜、無(wú)芽胞、無(wú)動(dòng)力的專(zhuān)性厭氧細(xì)菌，分產(chǎn)腸毒素型和非產(chǎn)腸毒素型。脆弱擬桿菌作為人及動(dòng)物腸道正常菌群的一部分，主要存于結(jié)腸中，此外，呼吸道、胃腸道及泌尿生殖道粘膜也可定植生長(zhǎng)。目前研究較多的是脆弱擬桿菌作為一種條件致病菌，當(dāng)宿主粘膜受損時(shí)，可侵犯粘膜下層，引起感染，也可經(jīng)血液流動(dòng)，引起身體其它器官如腸道、腹腔、肝、肺、腦組織化膿性感染并伴發(fā)膿腫和引起急慢性腹瀉等。此外，其對(duì)結(jié)腸、直腸癌的發(fā)生也有促進(jìn)作用。然而，脆弱擬桿菌并非只是一種條件致病菌。1991年張季階發(fā)表了《一種無(wú)毒脆弱擬桿菌的分離鑒定》，報(bào)導(dǎo)了關(guān)于1983年9月從一個(gè)發(fā)育良好的嬰兒糞便中分離出量大而又較純的細(xì)菌，經(jīng)以系列的鑒定、基礎(chǔ)試驗(yàn)和臨床應(yīng)用觀察，屬于脆弱擬桿菌群中的一株無(wú)毒菌，是人體的益生菌，定名為BF839菌株。由此，研究發(fā)現(xiàn)了，脆弱擬桿菌也是一種益生菌。但是，脆弱擬桿菌作為一種益生菌，并且在制備防治結(jié)腸癌組合物的相關(guān)應(yīng)用，目前尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，所述的脆弱擬桿菌保藏單位名稱為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2013年3月12日，保藏編號(hào)為CGMCCN0.728Q,分類(lèi)命名為 Bacteroides fragilis0為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
提供脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用。其中，所述組合物為至少含有防治結(jié)腸癌的脆弱擬桿菌的食品或藥物組合物。其中，所述組合物選自奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、奶基發(fā)酵食品、發(fā)酵谷類(lèi)食品、嬰兒食品或?qū)櫸锸称分械娜我庖环N。其中，所述組合物為丸劑、片劑、顆粒制劑、膠囊、口服液或者管飼制劑。其中，所述組合物 為含有所述脆弱擬桿菌的液體細(xì)菌懸浮液。其中，所述脆弱擬桿菌在所述組合物中的含量為KTlOiciCfu /mL。本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明發(fā)掘了脆弱擬桿菌新的用途，開(kāi)拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，脆弱擬桿菌在體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗腫瘤效應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)生存期，對(duì)于防治結(jié)腸癌具有很好的效果；而且脆弱擬桿菌安全無(wú)毒，藥理作用強(qiáng)，從而預(yù)示了脆弱擬桿菌具有很好的食用和藥用前景。脆弱擬桿菌作為一種益生菌，可用于制備防治結(jié)腸癌的食品或藥物組合物，為臨床提供一種適合人體服食的保健及預(yù)防良品。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1脆弱擬桿菌菌液的制備 (O由嬰兒糞便中分離脆弱擬桿菌
按“正常菌群檢查法”稱取0.5克大便，置于先裝有4.5ml生理鹽水的試管中，以此連續(xù)稀釋成10_卜10_6，由高稀積度向低稀積度滴到Bd培養(yǎng)基平板上，置于厭氧產(chǎn)氣盒中加厭氧產(chǎn)氣袋進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。置37°C，2 7天后開(kāi)罐檢查。選取單一菌落進(jìn)行純培養(yǎng)、染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生理生化檢測(cè)。(2)脆弱擬桿菌的增菌培養(yǎng)及菌液制備
選取純化后的單個(gè)菌落接種于改良的胰蛋白胨肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，所得菌液離心沉淀，轉(zhuǎn)速3000r/min,離心15min,去上清,沉淀物用生理鹽水洗漆后,沉淀物用生理鹽水稀釋?zhuān)名準(zhǔn)媳葷峁茏鼍鷶?shù)測(cè)定，稀釋至IO8 cfu /ml, IO9 cfu /ml, IO10 cfu /ml，保存?zhèn)溆?。?shí)施例2脆弱擬桿菌毒力實(shí)驗(yàn)
采用實(shí)施例1制備的脆弱擬桿菌菌液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
(O小鼠急性毒力實(shí)驗(yàn)
取體重22±2克C57BR/C小鼠(雌雄各半)60只，分成高劑量組、低劑量組和對(duì)照組，各組20只。高劑量組每只小鼠每天灌胃IO12 cfu /ml菌液0.5ml，低劑量組每天灌胃IO9 cfu/ml菌液0.5ml，對(duì)照組每天灌胃0.5ml生理鹽水。連續(xù)觀察14天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:小鼠正常生長(zhǎng)，未見(jiàn)死亡，LD50測(cè)不出。(2)大鼠毒力實(shí)驗(yàn)
取150±20克SD大鼠30只(雌雄各半)，分為3組:高低劑量組和對(duì)照組。高劑量組每只大鼠每天灌胃1012cfu/ml菌液2ml,低劑量組每天灌胃109cfu/ml菌液2ml,對(duì)照組每天灌胃2ml生理鹽水。連續(xù)觀察14天，14天后抽靜脈血測(cè)血象、肝腎功。取胃腸肝脾組織做病理切片電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:均未見(jiàn)明顯異常。(3)恒河猴毒力實(shí)驗(yàn)
取恒河猴10只(雌雄各半)，分為2組:高低劑量組和對(duì)照組。高劑量組每只恒河猴每天口服1012cfu/ml菌液100ml,低劑量組每天口服109cfu/ml菌液100ml。連續(xù)觀察60天。14天、30天、45天、60天后分別抽靜脈血測(cè)血象、肝腎功，測(cè)心電圖。取胃腸肝脾組織做病理切片電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:均未見(jiàn)明顯異常。 實(shí)施例3脆弱擬桿菌對(duì)于結(jié)腸癌的預(yù)防作用 采用實(shí)施例1制備的脆弱擬桿菌菌液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
動(dòng)物模型建立:將60只ICR小鼠隨機(jī)分為2大組，即:生理鹽水組(10只)和模型組(50只)。將1，2- 二甲肼(DMH)溶于生理鹽水中，使其終濃度為20mg/kg，用0.25mol/L NaOH調(diào)整pH至6.5，腹腔注射予小鼠。I周后，在模型組的飲水中添加右旋葡聚糖苷鈉(DSS)，濃度為20g/L，給予小鼠連續(xù)飲用7天。在小鼠出現(xiàn)第二次血便時(shí)，及給予DMH后的第9周，按體質(zhì)量隨機(jī)將模型小鼠分為4組，即:模型組(20只)和脆弱擬桿菌組:高劑量組(IO9Cfu/ml)、中劑量組(108cfu/ml)、低劑量組(107cfu/ml)。脆弱擬桿菌菌液灌胃，每天I次,每次
0.5ml,共 11 周。評(píng)價(jià)指標(biāo):實(shí)驗(yàn)第20周，乙醚麻醉小鼠。剪開(kāi)小鼠腹腔，在冰浴中從肛門(mén)向上截取結(jié)腸8cm，用生理鹽水沖洗后，濾紙吸干，稱體質(zhì)量。記錄結(jié)腸腫瘤數(shù)目，取結(jié)腸約Icm做病
理檢查。結(jié)果:模型組小鼠在第20周，50%的小鼠出現(xiàn)脫肛，而脆弱擬桿菌三個(gè)劑量組未見(jiàn)脫肛小鼠。模型組有超過(guò)80%的小鼠結(jié)腸出現(xiàn)了一個(gè)或者多個(gè)腫瘤，結(jié)腸充血增厚。而脆弱擬桿菌低劑量組僅有3只出現(xiàn)結(jié)腸腫瘤，高中劑量組僅有I只出現(xiàn)。病理結(jié)果表明，模型組細(xì)胞排列紊亂、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，邊界模糊，診斷為腺瘤樣增生；脆弱擬桿菌三個(gè)劑量組粘膜缺失，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，呈典型炎癥改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脆弱擬桿菌成功地將小鼠結(jié)腸停留在炎癥狀態(tài)，阻止了結(jié)腸炎向結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)變。由此可見(jiàn)，脆弱擬桿菌對(duì)結(jié)腸癌有很好的預(yù)防作用。實(shí)施例4脆弱擬桿菌對(duì)于結(jié)腸癌的治療作用 采用實(shí)施例1制備的脆弱擬桿菌菌液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
BALB/c小鼠30只，每只鼠背部皮下接種CT26細(xì)胞(1*105細(xì)胞/只)，接種次日將小鼠隨機(jī)分為2組，每組15只。第一組為生理鹽水組，每天灌胃0.5ml生理鹽水；第二組為脆弱擬桿菌組，灌胃脆弱擬桿菌菌液，每只灌胃量0.5ml*109cfu/ml，共30天。觀察用藥30天時(shí)腫瘤大小，荷瘤鼠生存期，部分小鼠處死進(jìn)行原位細(xì)胞凋亡分析(TU NEL)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:脆弱擬桿菌組結(jié)腸腫塊明顯小于生理鹽水組，平均生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于生理鹽水組。脆弱擬桿菌組小鼠腫瘤細(xì)胞(CT26)凋亡陽(yáng)性數(shù)明顯高于生理鹽水對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脆弱擬桿菌在體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗腫瘤效應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)生存期。說(shuō)明了脆弱擬桿菌對(duì)于結(jié)腸癌有很好的治療作用。
權(quán)利要求
1.脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為至少含有能防治結(jié)腸癌的脆弱擬桿菌的食品或藥物組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物選自奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、奶基發(fā)酵食品、發(fā)酵谷類(lèi)食品、嬰兒食品或?qū)櫸锸称分械娜我庖环N。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為丸劑、片劑、顆粒制劑、膠囊、口服液或者管飼制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為含有所述脆弱擬桿菌的液體細(xì)菌懸浮液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述脆弱擬 桿菌在所述組合物中的含量為IO8IOiciCfu /mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及脆弱擬桿菌的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，脆弱擬桿菌在體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗腫瘤效應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)生存期，對(duì)于防治結(jié)腸癌具有很好的效果。本發(fā)明發(fā)掘了脆弱擬桿菌新的用途，開(kāi)拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域，預(yù)示了脆弱擬桿菌具有很好的食用和藥用前景。脆弱擬桿菌作為一種益生菌，可用于制備防治結(jié)腸癌的食品或藥物組合物，為臨床提供一種適合人體服食的保健及預(yù)防良品。
文檔編號(hào)A61K35/74GK103142656SQ20131008570
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者智發(fā)朝, 白楊, 劉洋洋 申請(qǐng)人:廣州知光生物科技有限公司