專利名稱：厚殼貽貝脂溶性提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗炎癥性腸病活性的厚殼貽貝脂溶性提取物及其制備方法，以及它在制備抗炎癥性腸病藥物或保健食品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
貽貝屬軟體動物門貽貝科，是我國傳統(tǒng)的養(yǎng)殖貝類，具有生長快、繁殖力強(qiáng)、抗病能力和適應(yīng)性強(qiáng)，易于人工養(yǎng)殖等特點(diǎn)。目前我國人工養(yǎng)殖的貝類主要有紫貽貝、翡翠貽貝和厚殼貽貝等。我國貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)量極大，年產(chǎn)量達(dá)到56.83萬噸，浙江省作為海洋大省貽貝資源尤其豐富，年產(chǎn)量達(dá)到4萬噸。然而，貽貝在我國被認(rèn)為是一種低值海產(chǎn)品，雖有極豐富的資源，但經(jīng)濟(jì)價(jià)值低，沒有被充分利用，在我國貽貝主要是新鮮或粗加工后供民間食用，以活鮮品銷售為主，銷售范圍狹窄，深加工率較低。
貽貝作為海洋生物中的重要一族，具有重要的藥用價(jià)值，中國古代《本草拾遺》就記載貽貝“主虛贏勞損，因產(chǎn)瘦瘠，血?dú)饨Y(jié)積，腹冷，腸鳴，下痢腰痛，帶下”。近現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明貽貝具有抗炎、抗癌、抗心血管疾病等作用。國外流行病學(xué)、動物和人體試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，新西蘭翡翠貽貝脂溶性提取物具有顯著的抗炎作用，對慢性關(guān)節(jié)炎，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等具有很好的療效。動物試驗(yàn)研究表明，新西蘭翡翠貽貝的脂溶性提取物-Lyprinol具有顯著的抗關(guān)節(jié)炎作用，其抗炎效果比治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的消炎痛強(qiáng)，比其它抗炎油(n-3多不飽和油)和抗關(guān)節(jié)炎油(夜來香油)對預(yù)防佐劑誘導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎腫脹強(qiáng)200倍以上。臨床試驗(yàn)研究表明，新西蘭翡翠貽貝脂溶性提取物對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎以及骨質(zhì)疏松引起的關(guān)節(jié)痛和關(guān)節(jié)腫脹都有很好的緩解和治療作用。我國對貽貝的抗炎活性也有相關(guān)報(bào)道，袁高峰等對厚殼貽貝的抗炎活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示經(jīng)冷凍干燥和氯仿∶甲醇(2∶1，V∶V)溶液提取得到的厚殼貽貝脂溶性提取物具有與新西蘭翡翠貽貝相似的抗多發(fā)性關(guān)節(jié)炎活性。
貽貝中的抗炎活性成分主要是不飽和脂肪酸，而不飽和脂肪酸特別是多不飽和脂肪酸很容易被氧化，因此在貽貝脂溶性提取物的制備過程中，如何最大限度的避免不飽和脂肪酸的氧化就成為最主要的技術(shù)關(guān)鍵。然而，目前對貽貝脂溶性物質(zhì)的提取并沒有充分考慮到這一點(diǎn)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種厚殼貽貝脂溶性提取物及其制備方法，該厚殼貽貝脂溶性提取物具有抗炎癥性腸病的作用，可以應(yīng)用于制備各種類型的抗炎癥性腸病藥物或保健食品。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法，包括以下步驟 1)、厚殼貽貝預(yù)處理將厚殼貽貝清洗、去殼、留肉；然后在厚殼貽貝肉中加入酒石酸作為穩(wěn)定劑，充分?jǐn)嚢杌靹?，接著進(jìn)行攪碎處理，得厚殼貽貝碎肉； 2)、冷凍干燥先將厚殼貽貝碎肉進(jìn)行冷凍干燥；然后將所得的凍干厚殼貽貝肉在粉碎機(jī)中粉碎，得到厚殼貽貝肉凍干粉； 3)、超臨界CO2萃取將厚殼貽貝肉凍干粉進(jìn)行超臨界CO2萃取，得到厚殼貽貝脂溶性提取物。
作為本發(fā)明的厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法的改進(jìn)步驟1)的厚殼貽貝預(yù)處理在0～15℃的溫度下進(jìn)行；酒石酸與厚殼貽貝肉的重量比為1％～7％。
作為本發(fā)明的厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟2)冷凍干燥的工藝條件為將厚殼貽貝碎肉平鋪至厚度為3～15mm，凍結(jié)時(shí)間4～6h，凍結(jié)溫度-20～-30℃，冷阱溫度-40～-70℃；真空度10～50pa，凍干最終溫度20～30℃，干燥時(shí)間15～24h。
作為本發(fā)明的厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟3)的超臨界CO2萃取為分離釜I的壓力為7～8MPa，溫度為60℃；分離釜II的壓力為4～6MPa，溫度為35℃；萃取釜壓力為15～35MPa，溫度為35～55℃；CO2流量為萃取釜容量的10～20倍/h；萃取時(shí)間為1～3h，每隔15～45min收集脂溶性提取物。
本發(fā)明還同時(shí)提供了按照上述方法制備的厚殼貽貝脂溶性提取物，其為含有多種不飽和脂肪酸的抗炎活性物質(zhì)。
本發(fā)明還同時(shí)提供了厚殼貽貝脂溶性提取物在制備抗炎癥性腸病藥物或保健食品中的應(yīng)用。
在本發(fā)明中，步驟1)所得的產(chǎn)物應(yīng)該立刻進(jìn)行步驟2)、或者快速冷凍于-20℃冷庫中備用。
在本發(fā)明中，步驟1)的厚殼貽貝預(yù)處理優(yōu)選溫度為0～10℃；步驟2)冷凍干燥的優(yōu)選工藝條件為物料厚度5-10mm，凍結(jié)時(shí)間5小時(shí)，凍結(jié)終點(diǎn)溫度-25℃，冷阱溫度-50～-60℃，真空度25～50pa，凍干最終溫度25℃，干燥時(shí)間19h；步驟3)超臨界CO2萃取的優(yōu)選工藝條件為分離釜I的壓力為7～8MPa，溫度為60℃；分離釜II的壓力為4～6MPa，溫度為35℃；萃取釜壓力為30MPa，溫度為45℃；CO2流量為萃取釜容量的15倍/h；萃取時(shí)間為2h，每隔30min收集脂溶性提取物。
本發(fā)明的發(fā)明人對厚殼貽貝脂溶性提取物的制備進(jìn)行了研究，從而開發(fā)了一種更具優(yōu)勢的制備方法。此外，盡管國內(nèi)外對貽貝抗炎活性的研究都有相關(guān)報(bào)道，但僅僅是局限于其對抗關(guān)節(jié)炎活性方面的研究，而對其它抗炎活性方面的研究還沒有報(bào)道。發(fā)明人對厚殼貽貝脂溶性提取物進(jìn)行了抗炎癥性腸病活性研究，發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明的制備方法所得的厚殼貽貝脂溶性提取物具有很強(qiáng)的抗炎癥性腸病活性。
厚殼貽貝肉經(jīng)本發(fā)明的冷凍干燥和超臨界CO2萃取所得的脂溶性提取物具有較強(qiáng)的抗炎癥性腸病(IBD)活性。本發(fā)明所制備的脂溶性提取物是一種琥珀色透明的油狀物，經(jīng)氣相色譜檢測分析，其主要含有多種不飽和脂肪酸，其中多不飽和脂肪酸含量為40～50％，單不飽和脂肪酸的含量為15～20％。本發(fā)明提供的制備方法與傳統(tǒng)的制備方法(文獻(xiàn)上已報(bào)道的制備方法，如背景技術(shù)中所述)相比，具有無法比擬的優(yōu)勢，其所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物的多不飽和脂肪酸含量顯著高于傳統(tǒng)的制備方法。以春季厚殼貽貝為例，具體見表1。
表1本發(fā)明的制備方法與傳統(tǒng)制備方法所得春季厚殼貽貝脂溶性提取物的多不飽和脂肪酸含量比較表 注MUFA＝單不飽和脂肪酸，PUFA＝多不飽和脂肪酸 表中所有數(shù)據(jù)的表達(dá)形式均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)，同列數(shù)據(jù)后面的字母完全不同表示具有顯著性差異(p＜0.05)，字母不完全相同或完全相同表示沒有顯著性差異(p＞0.05)。
本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物通過動物實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其能減輕炎癥性腸病癥狀，對炎癥性腸病有一定的預(yù)防和治療作用。本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物可以單獨(dú)或者與其他活性成分結(jié)合使用，并制成預(yù)防和治療炎癥性腸病的保健食品或藥品。本發(fā)明所制備的脂溶性提取物在制備保健食品或藥品時(shí)，可以選擇性的使用一些常用的賦形劑，并采用常規(guī)的制劑制備方法將其制成各種制劑，優(yōu)選膠囊或滴丸。本發(fā)明所制備的脂溶性提取物采用口服的方式，作為藥物時(shí)，建議服用量為成人每天100～600mg；作為保健食品時(shí)，建議服用量為成人每天100～200mg。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn) (1)、本發(fā)明的整個(gè)制備過程能最大限度地避免不飽和脂肪酸的氧化，其所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物中不飽和脂肪酸的含量更高； (2)本發(fā)明的制備過程屬于純物理的過程，因此不會產(chǎn)生溶劑殘留問題，安全性大大提高； (3)本發(fā)明的制備工藝簡單，投資少，且適合于工業(yè)化生產(chǎn)； (4)本發(fā)明制備的厚殼貽貝脂溶性提取物具有更強(qiáng)的抗炎癥性腸病活性。

具體實(shí)施例方式 結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作更加詳細(xì)的描述。以下實(shí)施例，可選用春季厚殼貽貝。
實(shí)施例1、一種厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟 1)、厚殼貽貝預(yù)處理 收集100kg新鮮的厚殼貽貝，迅速將其清洗、去殼，得到35kg新鮮的厚殼貽貝肉；在上述厚殼貽貝肉中加入酒石酸作為穩(wěn)定劑(添加量為每100g厚殼貽貝肉中加入4g酒石酸)，然后放入攪拌機(jī)中充分?jǐn)嚢杌靹?；混勻后再放入絞肉機(jī)中攪碎，得到厚殼貽貝碎肉。
上述整個(gè)預(yù)處理過程均在0～10℃的溫度下進(jìn)行。
2)、冷凍干燥 可選用浙江三雄機(jī)械制造有限公司生產(chǎn)的FDG系列大型真空冷凍干燥設(shè)備，將上述全部的厚殼貽貝碎肉進(jìn)行冷凍干燥，干燥工藝條件為將厚殼貽貝碎肉平鋪至厚度5～10mm，凍結(jié)時(shí)間5h，凍結(jié)終點(diǎn)溫度-25℃，冷阱溫度-50～-60℃，真空度25～50pa，凍干最終溫度25℃，干燥時(shí)間19h。經(jīng)過冷凍干燥后共得到6kg凍干厚殼貽貝肉。將凍干厚殼貽貝肉放入粉碎機(jī)中粉碎并過篩(50目)，得到5.9kg厚殼貽貝凍干粉。
3)、超臨界CO2萃取 選用萃取釜容積為20L的超臨界CO2萃取設(shè)備(例如可選用江蘇南通華安超臨界萃取設(shè)備有限公司生產(chǎn)的HA121型超臨界CO2萃取設(shè)備) 將厚殼貽貝凍干粉放入上述萃取釜容積為20L的超臨界CO2萃取設(shè)備中進(jìn)行超臨界萃取，萃取工藝條件為分離釜I的壓力為7～8MPa，溫度為60℃；分離釜II的壓力為4～6MPa，溫度為35℃；萃取釜壓力為30MPa，溫度為45℃；CO2流量為300L/h；萃取時(shí)間為2h。
萃取過程中，每隔30min收集脂溶性提取物；萃取完畢后，共得到377g厚殼貽貝脂溶性提取物。
采用上述工藝制備的厚殼貽貝脂溶性提取物的得率為0.377％，經(jīng)氣相色譜檢測分析，其主要含有多種不飽和脂肪酸，其中單不飽和脂肪酸的含量為18.89％，多不飽和脂肪酸含量為48.18％。
實(shí)施例2、一種厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟 1)、厚殼貽貝預(yù)處理 按照每100g厚殼貽貝肉中加入1g酒石酸的配比關(guān)系加入酒石酸作為穩(wěn)定劑；其余同實(shí)施例1的步驟1)。
2)、冷凍干燥 將上述全部的厚殼貽貝碎肉進(jìn)行冷凍干燥，干燥工藝條件為將厚殼貽貝碎肉平鋪至厚度3～5mm，凍結(jié)時(shí)間4h，凍結(jié)終點(diǎn)溫度-20℃，冷阱溫度-40～-50℃，真空度30～50pa，凍干最終溫度20℃，干燥時(shí)間15h。經(jīng)過冷凍干燥后共得到5.6kg凍干厚殼貽貝肉。將凍干貽貝肉放入粉碎機(jī)中粉碎并過篩(50目)，得到5.55kg厚殼貽貝凍干粉。
3)、超臨界CO2萃取 將厚殼貽貝凍干粉放入萃取釜容積為20L的超臨界CO2萃取設(shè)備中進(jìn)行超臨界萃取，萃取工藝條件為分離釜I的壓力為7～8MPa，溫度為60℃；分離釜II的壓力為4～6MPa，溫度為35℃；萃取釜壓力為15MPa，溫度為35℃；CO2流量為200L/h；萃取時(shí)間為3h。
萃取過程中，每隔45min收集脂溶性提取物；萃取完畢后，共得到285g厚殼貽貝脂溶性提取物。
采用上述工藝制備的厚殼貽貝脂溶性提取物的得率為0.285％，經(jīng)氣相色譜檢測分析，其主要含有多種不飽和脂肪酸，其中單不飽和脂肪酸的含量為16.63％，多不飽和脂肪酸含量為45.57％。
實(shí)施例3、一種厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟 1)、厚殼貽貝預(yù)處理 按照每100g厚殼貽貝肉中加入7g酒石酸的配比關(guān)系加入酒石酸作為穩(wěn)定劑；其余同實(shí)施例1的步驟1)。
2)、冷凍干燥 將上述全部的厚殼貽貝碎肉進(jìn)行冷凍干燥，干燥工藝條件為將厚殼貽貝碎肉平鋪至厚度10～15mm，凍結(jié)時(shí)間6h，凍結(jié)終點(diǎn)溫度-30℃，冷阱溫度-60～-70℃，真空度10～30pa，凍干最終溫度30℃，干燥時(shí)間24h。經(jīng)過冷凍干燥后共得到7kg凍干厚殼貽貝肉。將凍干貽貝肉放入粉碎機(jī)中粉碎并過篩，得到6.6kg厚殼貽貝凍干粉。
3)、超臨界CO2萃取 將厚殼貽貝凍干粉放入萃取釜容積為20L的超臨界CO2萃取設(shè)備中進(jìn)行超臨界萃取，萃取工藝條件為分離釜I的壓力為7.5MPa，溫度為60℃；分離釜II的壓力為5MPa，溫度為35℃；萃取釜壓力為35MPa，溫度為55℃；CO2流量為400L/h；萃取時(shí)間為1h。
萃取過程中，每隔15min收集脂溶性提取物；萃取完畢后，共得到310g厚殼貽貝脂溶性提取物。
采用上述工藝制備的厚殼貽貝脂溶性提取物的得率為0.31％，經(jīng)氣相色譜檢測分析，其主要含有多種不飽和脂肪酸，其中單不飽和脂肪酸的含量為18.65％，多不飽和脂肪酸含量為47.72％。
實(shí)施例4、厚殼貽貝軟膠囊的制備 軟膠囊囊皮液的制備軟膠囊囊皮液的材料為明膠，甘油和水，它們的重量比例為10∶4∶9.8。具體制備過程為分別取100g明膠、40g甘油和98g水，在明膠中加入適量水使其吸水膨脹，另將甘油及余下的水置煮膠鍋中加熱至70℃，混合均勻，然后加入膨脹的明膠，攪拌、熔融、保溫，真空抽氣以除去氣泡，并過濾，得軟膠囊囊皮液。
軟膠囊囊心液的制備取實(shí)施例1所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物500g，與1500g初榨橄欖油及2.5g維生素E充分?jǐn)嚢杌靹颍密浤z囊囊心液。
軟膠囊的制備將已制備好的軟膠囊囊皮液和囊心液裝入自動旋轉(zhuǎn)軋囊機(jī)中，噴體溫度控制在50-55℃，囊心液溫度控制在25～30℃，壓制出每粒含400mg藥液的軟膠囊，然后將軟膠囊放在溫度為35℃、相對濕度為30％的干燥箱中干燥6h左右，便得到厚殼貽貝軟膠囊。此軟膠囊每粒含100mg厚殼貽貝脂溶性提取物。
實(shí)驗(yàn)、厚殼貽貝脂溶性提取物抗小鼠炎癥性腸病實(shí)驗(yàn) 1實(shí)驗(yàn)材料 本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物如實(shí)施例1所得； 傳統(tǒng)方法制備的厚殼貽貝脂溶性提取物將新鮮的厚殼貽貝肉直接進(jìn)行冷凍干燥并粉碎，然后以厚殼貽貝凍干粉為原料，采用溶劑提取法(氯仿∶甲醇＝2∶1，V∶V)過夜提取并濃縮，得到厚殼貽貝脂溶性提取物； 葡聚糖硫酸鈉(DSS)美國Sigma公司； 大豆油益海嘉里投資有限公司。
2實(shí)驗(yàn)動物 6周齡C57BL/6雄性小鼠60只，由浙江大學(xué)動物中心提供。
3實(shí)驗(yàn)方法 3.1炎癥性腸病小鼠模型的建立將分子量為5000的DSS溶于飲用水，配成2％的DSS溶液，讓C57BL/6小鼠自由飲用7d，建立炎癥性腸病小鼠模型。模型建立成功的標(biāo)志為飲用2％的DSS溶液7d內(nèi)，出現(xiàn)半稀便、腹瀉、大便隱血(+)和肉眼血便中的任一癥狀。
3.2動物分組將60只6周齡C57BL/6雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后隨機(jī)分成6組，每組10只，其中一組為模型組，一組為大豆油對照組，一組為用傳統(tǒng)方法制備的厚殼貽貝脂溶性提取物對照組，其余3組為本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物治療組。
3.3給藥方法自DSS溶液飲用前1周起至DSS溶液飲用結(jié)束止，連續(xù)14d，每天上午給小鼠灌胃一次，灌胃量為10mL/kg。其中，大豆油對照組小鼠用純粹的大豆油進(jìn)行灌胃；厚殼貽貝脂溶性提取物對照組小鼠用濃度為20mg/mL的傳統(tǒng)方法制備的厚殼貽貝脂溶性提取物(以大豆油為溶劑)進(jìn)行灌胃，相當(dāng)于灌胃劑量為200mg/kg；厚殼貽貝脂溶性提取物治療組分別用濃度為5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物(以大豆油為溶劑)進(jìn)行灌胃，相當(dāng)于灌胃劑量為50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg；模型組在實(shí)驗(yàn)期間不進(jìn)行灌胃處理。
3.4實(shí)驗(yàn)取材及標(biāo)本制作 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用引頸法處死所有小鼠。取出每只小鼠的整個(gè)結(jié)腸和直腸，稱重，然后截取遠(yuǎn)端結(jié)腸(2cm)，沿腸系膜邊緣縱行剖開，在解剖鏡下觀察結(jié)腸大體形態(tài)。每只小鼠于有炎癥或潰瘍處取組織標(biāo)本(2mm×10mm)，10％甲醛溶液固定、常規(guī)石臘包埋、切片(4μm)，HE染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)改變。另取結(jié)腸的中間段(1.5cm)，迅速冷凍于液氮中用于髓過氧化物酶(MPO)測定。
3.5疾病觀察與檢測項(xiàng)目 3.5.1疾病活動指數(shù)(DAI)的評估 在給小鼠飲用DSS溶液以后，每日觀察小鼠的體重、大便性狀和隱血情況，按表2進(jìn)行評分。將體重下降、大便性狀和隱血情況的評分相加，得出每只小鼠的情況，以評估疾病活動情況。
表2、DAI評分標(biāo)準(zhǔn) 注正常大便成形大便；松散大便不黏附于肛門的糊狀、半成形大便；稀便可黏附于肛門的稀水樣便。
3.5.2結(jié)腸組織學(xué)損傷的評估 結(jié)腸組織學(xué)損傷通過觀察結(jié)腸組織學(xué)病理的改變來進(jìn)行評估，其評價(jià)方法按表3的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。組織學(xué)損傷程度用炎癥、病變深度、陷窩破壞評分與病變范圍評分的和表示。
表3、結(jié)腸組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)
3.5.3MPO活性檢測 采用小鼠MPO檢測試劑盒進(jìn)行測定。
4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均在Microsoft Excel 2003和SPSS for Windows 16.0中進(jìn)行。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行單因素方差分析(One-wayANOVA)，并用Duncan比較各組數(shù)據(jù)間的差異，p＜0.05視為兩組數(shù)據(jù)存在顯著性差異。
5實(shí)驗(yàn)結(jié)果 5.1厚殼貽貝脂溶性提取物對炎癥性腸病小鼠DAI的影響 不同組別炎癥性腸病小鼠每日的DAI見表4。
表4、不同組別炎癥性腸病小鼠每日DAI
注對照組1＝大豆油對照組； 對照組2＝灌胃劑量為200mg/kg的傳統(tǒng)方法制備的厚殼貽貝脂溶性提取對照組； 治療組1＝低劑量組，灌胃劑量為50mg/kg的本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物治療組； 治療組2＝中劑量組，灌胃劑量為100mg/kg的本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物治療組； 治療組3＝高劑量組，灌胃劑量為200mg/kg的本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物治療組； 表中所有數(shù)據(jù)的表達(dá)形式均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)，同列數(shù)據(jù)后面的字母完全不同表示具有顯著性差異(p＜0.05)，字母不完全相同或完全相同表示沒有顯著性差異(p＞0.05)。
模型組小鼠在飲用DSS溶液2天內(nèi)全部表現(xiàn)正常，到第3天，有2只小鼠出現(xiàn)體重下降和大便松散現(xiàn)象；到第4天和第5天，大部分小鼠均出現(xiàn)不同程度的體重下降和稀便現(xiàn)象，部分還出現(xiàn)大便隱血甚至肉眼血便；第6天以后，所有小鼠都出現(xiàn)較為嚴(yán)重的炎癥性腸病癥狀，絕大部分小鼠的體重下降達(dá)到10％以上，并伴有明顯的肉眼血便。從表4中可以看出，模型組小鼠的DAI從飲用DSS溶液第3天起，呈快速上升趨勢，到第6天，DAI值上升到8.4，表明造模非常成功。
對照組1小鼠在飲用DSS溶液后，其炎癥性腸病癥狀與模型組相似，每日的DAI(見表4)與模型組比較，沒有顯著性差異，表明大豆油對DAI沒有影響。
對照組2小鼠在飲用DSS溶液后，其每日的DAI值(見表4)顯著低于模型組和對照組1，表明傳統(tǒng)方法所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物具有一定的抗炎癥性腸病活性。
本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物治療組小鼠在飲用DSS溶液3天內(nèi)均沒有出現(xiàn)炎癥性腸病癥狀。其中治療組1(低劑量組)部分小鼠在飲用DSS溶液第4天出現(xiàn)了不同程度的癥狀，并且在隨后的3天內(nèi)，癥狀逐漸加劇。從表4中得出，治療組1小鼠在飲用DSS溶液第4天和第5天的DAI值顯著低于模型組及對照組1，但是到第6、7天，其DAI值與模型組及對照組1沒有顯著性差異，表明低劑量的厚殼貽貝脂溶性提取物可以推遲炎癥性腸病的發(fā)病時(shí)間，但對其治療作用不明顯；與對照組2相比，治療組1的抗炎癥性腸病效果較弱，其每日DAI都顯著高于對照組2，表明本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物在低劑量(50mg/kg)的情況下，其抗炎癥性腸病效果弱于劑量為200mg/kg的傳統(tǒng)方法所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物。治療組2(中劑量組)小鼠在飲用DSS溶液4天內(nèi)都沒有出現(xiàn)炎癥性腸病癥狀，其DAI值均為0，到第5天，才發(fā)現(xiàn)有2只小鼠出現(xiàn)大便松散現(xiàn)象，在隨后的2天內(nèi)，疾病癥狀有所加劇，但不明顯，其每日的DAI值都顯著低于模型組和對照組，表明中劑量的厚殼貽貝脂溶性提取物對炎癥性腸病有較強(qiáng)的治療作用，能顯著降低炎癥性腸病小鼠的疾病活動指數(shù)；與對照組2相比，治療組2的抗炎癥性腸病效果相當(dāng)，其每日DAI值與對照組2沒有顯著性差異，表明本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物在中劑量(100mg/kg)的情況下就具有與劑量為200mg/kg的傳統(tǒng)方法所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物相同的抗炎癥性腸病效果。治療組3(高劑量組)小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間(除了最后1天)，幾乎都沒有出現(xiàn)炎癥性腸病癥狀，其DAI值在飲用DSS溶液前6天都為0，第7天也只有0.9，表明高劑量的厚殼貽貝脂溶性提取物具有很強(qiáng)的抗炎癥性腸病活性，對炎癥性腸病有很好的預(yù)防和治療效果；與對照組2相比，治療組3的抗炎癥性腸病效果更強(qiáng)，其每日DAI值顯著低于對照組2，表明在相同劑量(200mg/kg)的情況下，本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物的抗炎癥性腸病效果顯著強(qiáng)于傳統(tǒng)方法所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物。
5.2厚殼貽貝脂溶性提取物對炎癥性腸病小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷的影響 不同組別炎癥性腸病小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷評分見表5，從表中可以看出，模型組小鼠的結(jié)腸組織學(xué)損傷很嚴(yán)重，達(dá)到了11.4，對照組1小鼠(結(jié)腸組織學(xué)損傷評分為10.9)也較嚴(yán)重，并與模型組小鼠沒有顯著性差異。對照組2和所有治療組小鼠雖有不同程度的結(jié)腸組織學(xué)損傷，但都低于模型組和對照組1，特別是對照組2、治療組2和治療組3，其結(jié)腸組織學(xué)損傷評分只有4.1、4.3和1.2，顯著低于模型組和對照組1，表明傳統(tǒng)方法制備的和本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物對炎癥性腸病小鼠的結(jié)腸都有保護(hù)作用，但在相同劑量(200mg/kg)的情況下，本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物對炎癥性腸病小鼠的結(jié)腸具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。
表5、不同組別炎癥性腸病小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷評分 注同表3。
5.3厚殼貽貝脂溶性提取物對炎癥性腸病小鼠結(jié)腸和直腸的重量及結(jié)腸MPO活性的影響 不同組別炎癥性腸病小鼠結(jié)腸和直腸的重量及結(jié)腸MPO活性見表5。由表5得，模型組和對照組小鼠的結(jié)腸及直腸重量沒有顯著性差異，但是治療組小鼠的結(jié)腸及直腸重量顯著低于模型組和對照組，且隨著厚殼貽貝脂溶性提取物劑量的提高，治療組小鼠的結(jié)腸和直腸重量都有下降趨勢，表明本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物能減小炎癥性腸病小鼠結(jié)腸和直腸的水腫、充血、炎性細(xì)胞浸潤等病變；與傳統(tǒng)方法所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物相比，其效果相當(dāng)。從表中還可以看出，治療組小鼠(除治療組1)結(jié)腸MPO活性顯著低于模型組和對照組，且其活性隨著厚殼貽貝脂溶性提取物劑量的升高而降低，表明本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物具有降低炎癥性腸病小鼠結(jié)腸MPO活性的效果。與傳統(tǒng)方法所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物相比，其效果更強(qiáng)。
6結(jié)論 通過厚殼貽貝脂溶性提取物抗小鼠炎癥性腸病實(shí)驗(yàn)，我們得出本發(fā)明所制備的厚殼貽貝脂溶性提取物具有較強(qiáng)的抗炎癥性腸病活性，它能降低小鼠炎癥性腸病的疾病活動指數(shù)，減少結(jié)腸的組織學(xué)損傷，阻止結(jié)腸和直腸的炎癥性病變，同時(shí)還能抑制小鼠結(jié)腸的髓過氧化物酶活性；并且隨著厚殼貽貝脂溶性提取物灌胃劑量的提高，其抗炎癥性腸病活性不斷增強(qiáng)。與傳統(tǒng)方法制備的厚殼貽貝脂溶性提取物相比，其抗炎癥性腸病活性更強(qiáng)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法，其特征是包括以下步驟
1)、厚殼貽貝預(yù)處理將厚殼貽貝清洗、去殼、留肉；然后在厚殼貽貝肉中加入酒石酸作為穩(wěn)定劑，充分?jǐn)嚢杌靹?，接著進(jìn)行攪碎處理，得厚殼貽貝碎肉；
2)、冷凍干燥先將厚殼貽貝碎肉進(jìn)行冷凍干燥；然后將所得的凍干厚殼貽貝肉在粉碎機(jī)中粉碎，得到厚殼貽貝肉凍干粉；
3)、超臨界CO2萃取將厚殼貽貝肉凍干粉進(jìn)行超臨界CO2萃取，得到厚殼貽貝脂溶性提取物。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法，其特征是整個(gè)步驟1)的厚殼貽貝預(yù)處理在0～15℃的溫度下進(jìn)行；酒石酸與厚殼貽貝肉的重量比為1％～7％。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法，其特征是所述步驟2)冷凍干燥的工藝條件為將厚殼貽貝碎肉平鋪至厚度為3～15mm，凍結(jié)時(shí)間4～6h，凍結(jié)溫度-20～-30℃，冷阱溫度-40～-70℃；真空度10～50pa，凍干最終溫度20～30℃，干燥時(shí)間15～24h。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法，其特征是所述步驟3)的超臨界CO2萃取為分離釜I的壓力為7～8MPa，溫度為60℃；分離釜II的壓力為4～6MPa，溫度為35℃；萃取釜壓力為15～35MPa，溫度為35～55℃；CO2流量為萃取釜容量的10～20倍/h；萃取時(shí)間為1～3h，每隔15～45min收集脂溶性提取物。
5、如權(quán)利要求1～4中任意一種方法制備的厚殼貽貝脂溶性提取物，其特征是為含有多種不飽和脂肪酸的抗炎活性物質(zhì)。
6、如權(quán)利要求5所述的厚殼貽貝脂溶性提取物在制備抗炎癥性腸病藥物或保健食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種厚殼貽貝脂溶性提取物的制備方法，包括以下步驟1)厚殼貽貝預(yù)處理；2)冷凍干燥先將厚殼貽貝碎肉進(jìn)行冷凍干燥；然后將所得的凍干厚殼貽貝肉在粉碎機(jī)中粉碎；3)超臨界CO2萃取將厚殼貽貝肉凍干粉進(jìn)行超臨界CO2萃取，得到厚殼貽貝脂溶性提取物。本發(fā)明還同時(shí)公開了按照上述方法制備而得的厚殼貽貝脂溶性提取物，為含有多種不飽和脂肪酸的抗炎活性物質(zhì)；能用于制備抗炎癥性腸病藥物或保健食品。
文檔編號A61P29/00GK101606951SQ20091010113
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者李歸浦, 鐸 李, 牟月軍, 炯 勵(lì) 申請人:浙江大學(xué), 嵊泗縣東海貽貝科技創(chuàng)新服務(wù)有限公司