專利名稱：狐貍生長激素釋放激素cDNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及克隆獲得的狐貍生長激素釋放激素cDNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狐貍是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的毛皮獸，其生長主要受垂體產(chǎn)生和釋放的生長激素來控制，在達(dá)到體成熟后，生長激素的產(chǎn)生和釋放隨之減少。而生長激素又受到動(dòng)物本身下丘腦產(chǎn)生的生長激素釋放激素和生長激素釋放抑制激素的雙重控制。其中生長激素釋放激素促進(jìn)垂體產(chǎn)生和釋放生長激素，而生長激素釋放抑制激素則抑制生長激素的產(chǎn)生。二者協(xié)調(diào)作用，共同維持狐貍的生長速度。生長激素釋放激素在丘腦下部的弓狀核和腹內(nèi)側(cè)核產(chǎn)生，合成后即經(jīng)軸突運(yùn)輸并分泌到正中隆起，由此經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)到達(dá)腺垂體。然后刺激腺垂體產(chǎn)生生長激素。以人的生長激素釋放激素為例加以說明人生長激素釋放激素的前體是由108個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，其中N端前20個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列，在穿膜時(shí)被切除，經(jīng)過再加工，成熟的人生長激素釋放激素含有44個(gè)氨基酸殘基，44肽的順序?yàn)?NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-A Ia-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Ar g-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-COOH。該成熟蛋白經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)到達(dá)腺垂體，并與分泌GH 的嗜酸性細(xì)胞的膜上GHRH受體(GHRH-RP)結(jié)合，GHRH與受體結(jié)合后先激活一種對(duì)霍亂毒素敏感的(is蛋白，進(jìn)而(is激活膜上的腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使ATP轉(zhuǎn)變?yōu)閏AMP，導(dǎo)致cAMP 水平上升。而cAMP水平的上升又會(huì)促進(jìn)cAMP依賴性蛋白酶激酶A的調(diào)節(jié)亞基構(gòu)象的改變并活化，促進(jìn)相關(guān)蛋白的磷酸化，進(jìn)而影響到細(xì)胞的活性。cAMP引起的GH分泌有Ca2+依賴性，當(dāng)GHRH作用到生長激素分泌細(xì)胞時(shí)，60秒內(nèi)會(huì)使Ca2+的濃度提高，從而促進(jìn)GH分泌。 有證據(jù)表明Ca2+的阻斷可以終止cAMP對(duì)GH的釋放作用。由此可見GHRH對(duì)GH的分泌是通過cAMP與Ca2+介導(dǎo)的，通過該過程調(diào)節(jié)GH的合成與釋放[1]。由于GHRH呈脈沖式釋放， 相應(yīng)的垂體的GH也呈脈沖式波動(dòng)。生長激素釋放激素(GHRH) —般為44個(gè)氨基酸的多肽，完整的生物學(xué)活性決定于氨基酸的第1- 個(gè)氨基酸，半衰期7-50分鐘，可見其作用時(shí)間之短。不同動(dòng)物的生長激素釋放激素分子大小略有不同，豬、牛、狗、人和綿羊等幾種動(dòng)物的GHRH蛋白發(fā)揮作用的活性形式是44個(gè)氨基酸殘基的小肽。它們的同源性很高。如下所示狗YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGAKVRL豬YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGARVRL牛YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL人YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL綿羊YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL相對(duì)應(yīng)的不同動(dòng)物生長激素釋放激素的cDNA核苷酸序列的大小也有所不同，人的生長激素釋放激素最早在1974被分離純化并鑒定出來β]。目前很多動(dòng)物包括人的生長激素釋放激素cDNA基因已經(jīng)被克隆并公之于眾。人的cDNA序列為327個(gè)核苷酸，小鼠312，
3大鼠315，狗、牛、豬均為321個(gè)。多數(shù)序列都進(jìn)行了專利保護(hù)。如中國專利02100065. 4保護(hù)了羊的生長激素釋放激素的cDNA基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。00813372. 7(超級(jí)活性的豬生長激素釋放激素類似物)保護(hù)了優(yōu)化了的豬GHRH的
核苷酸和氨基酸序列。03822291. 4 (GHRH類似物)保護(hù)了優(yōu)化了的人GHRH的核苷酸序列和氨基酸。200610017214. 5保護(hù)了促進(jìn)仔豬生長、提高仔豬免疫力的GHRH藥物及制備方法。200510061609. 0保護(hù)了一種能促進(jìn)人體長高的GHRH藥物及其制劑。200710068659. 0保護(hù)了鹿茸促生長釋放因子(DEER GHRF)提取及其制備方法。CN1615151 (用于治療慢性病個(gè)體的質(zhì)粒介導(dǎo)的補(bǔ)充)和CN1649496 (改變個(gè)體的瘦體重和骨特性的組合物和方法)保護(hù)了根據(jù)不同動(dòng)物基因序列進(jìn)行了優(yōu)化的GHRH的人工序列。CN1635898對(duì)具有超級(jí)活性的豬生長激素釋放激素類似物進(jìn)行了保護(hù)。美國專利7，351，815和7，361，642均對(duì)犬的生長激素釋放激素的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行了保護(hù)。早在1997年，Draghia-Akli等通過肌肉注射豬GHRH表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了促進(jìn)豬體重增加的效果[3]后續(xù)的實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了同樣的結(jié)果[4’5’6]。在狗[7]、綿羊[8]體內(nèi)也獲得了較成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種克隆獲得的狐貍生長激素釋放激素cDNA及其應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，我們根據(jù)其他動(dòng)物GHRH的保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物上游引物為(如 SEQ ID No. 5 所示)5' ATGCCACTCTGGGTGTTC 3'，下游引物為(如 SEQ ID No. 6 所示)5' TCATCCTTGGGAGTTCC 3'。然后制備狐貍下丘腦的總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR，最后克隆獲得了狐貍GHRH的cDNA。其全序列如SEQ IDNo. 4所示，其中GHRH成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，它們分別編碼的氨基酸序列分別如SEQ ID No. 2和 SEQ ID No. 1 所示。根據(jù)本發(fā)明提供的狐貍GHRH成熟肽的cDNA，可以其為目的基因，采用真核表達(dá)載體如常用的PVAX1，將目的基因插入載體中，構(gòu)建成真核表達(dá)載體，肌肉注射入狐貍腿部肌肉中，可獲得狐貍生長速度加快，體重增加明顯的結(jié)果。也可利用本發(fā)明提供的狐貍GHRH 全序列，將其在常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)中大量表達(dá)，獲得狐貍GHRH，用于制備可促進(jìn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物狐貍的生長的活性物質(zhì)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建的重組質(zhì)粒的PCR鑒定圖，其中1 :DL-2000plus Marker (5kb, 3kb, 2kb, Ikb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；2，3 陰性克隆；4，5 陽性克隆。圖2為本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19-GHRHS酶切鑒定圖，其中1 :DL_2000 Marker (2kb, Ikb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；2 質(zhì)粒 pMD 19-GHRHS ；3 :PCR 鑒定；4 陰性對(duì)照；5 =BamH I 單切；6 =Sph I 單切；7 =Sph I+BamH I 雙切。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-GHRHS酶切鑒定圖，其中1 :DL_2000 Marker (2kb, lkb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；2 :質(zhì)粒 pVAXI-GHRHS ；3 =BamH I 單切；4 : Not I單切；5 :PCR鑒定；6 陰性對(duì)照；7 =Not I+BamH I雙切。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以狐貍GHRH成熟肽的核苷酸序列為目的基因，以pVAXl為真核表達(dá)載體，將目的基因插入載體中，構(gòu)建成真核表達(dá)載體，肌肉注射入狐貍腿部肌肉中，可獲得狐貍生長速度加快，體重增加明顯的結(jié)果。載體構(gòu)建過程如下用PCR方法將人生長激素的信號(hào)肽基因序列與狐貍生長激素釋放激素的成熟肽基因序列串聯(lián)，連接到T載體上(pMD19-GHRHS)，再用BamH I和EcoR I 分別雙切T載體上的目的基因和pVAXl空載體。將目的基因克隆入pVAXl載體中，經(jīng)PCR 和測序鑒定后(參見圖1)，再將PMD19-GHRHS和pVAXl-GHRHS載體進(jìn)行酶切鑒定(參見圖 2和3)。證實(shí)獲得了 pVAXl-GHRHS表達(dá)載體。將純化后的表達(dá)載體以50 μ g-100 μ g/只， 分別注射入20只2-4月齡的幼狐腿部肌肉，在取皮時(shí)稱重，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組平均增重高達(dá)800g。其中含人生長激素信號(hào)肽的上游引物ATGGCTACAGGCTCCCGGAC(如SEQ ID No. 7 所示)；下游引物CTATCAGAGTCGTACCTTTGCT (如 SEQ ID No. 8 所示)；PCR 反應(yīng)條件 950C IOmin, 94°C 30sec，53°C 30sec，72°C 30sec30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；酶切條件37°C。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。參考文獻(xiàn)1. Gracia-Navarro F, Castano JP, Malagon MM, Sanchez-Hormigo A, Luque RM, Hickey GJ, Peinado JR, Delgado Ε, Martinez-Fuentes AJ. Research progress in thestimulatory inputs regulating growth hormone (GH) secretion. Comp BiochemPhysiol B Biochem Mol Biol.2002 132(1) :141-50.2. Currie B. L, Johansson K. N. , Greibrokk T. , Folkers K. , Bowers C. Y. Identification and purification of factor A-GHRH from hypothalami which releasesgrowth hormone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974,60(2) :605_9o3. Draghia-Akli R, Fiorotto ML. A new ρIasmid-mediated approach tosupplement somatotropin production in pigs. J Anim Sci. 2004 82(13_suppl) E264-9。4.陳理銀，郭榮富，相振田，馮宇。豬生產(chǎn)中pGRF基因質(zhì)粒應(yīng)用研究，豬業(yè)科學(xué)， 2006 8 :14-6.5.張勇，周安國，吳德，朱宇旌，王康寧，楊鳳。仔豬骨骼肌注射pGRF基因質(zhì)粒的促生長及代謝調(diào)控效應(yīng)研究，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003 34(2) :147-51.6.張利宇，孫寶忠，王敏，種京華。生長激素釋放因子(GRF)基因質(zhì)粒的研究進(jìn)展，黑龍江畜牧獸醫(yī)，20069 :19-21.7. Draghia-Akli R, Cummings KK, Khan AS, Brown PA, Carpenter RH. Effectsof plasmid-mediated growth hormone releasing hormone supplementation in young, healthy Beagle dogs. J Anim Sci.2003 81(9) :2301-10.8. Meng QY,Chen ZQ,Yu ZQ,Xie QF,Li N. Increased body weight viainjecting myogenic Expression gowth hormone-releasing hormone (GHRH) ρIasmidDNA into sheep. Anim Biotech. 2004 15(2) :175-92.
權(quán)利要求
1.一種狐貍生長激素釋放激素，其特征在于，其成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所7J\ ο
2.如權(quán)利要求1所述的狐貍生長激素釋放激素，其特征在于，包括其前體肽的完整的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.編碼權(quán)利要求1所述的狐貍生長激素釋放激素的成熟肽的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
4.編碼權(quán)利要求2所述的狐貍生長激素釋放激素的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 4 所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述cDNA的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的宿主。
7.權(quán)利要求3或4所述的cDNA在制備可促進(jìn)狐貍生長的活性物質(zhì)中的應(yīng)用。
8.含有權(quán)利要求1或2所述的狐貍生長激素釋放激素的活性物質(zhì)，其可促進(jìn)狐貍生長。
全文摘要
本發(fā)明公開了狐貍生長激素釋放激素cDNA基因的全長核苷酸序列和成熟肽的核苷酸序列以及其分別編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。狐貍的生長激素釋放激素的cDNA序列是一個(gè)完整的開放閱讀框，共321個(gè)核苷酸序列，共編碼106個(gè)氨基酸；其成熟肽由132個(gè)核苷酸序列編碼，共編碼44個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明可用于狐貍等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的促生長。
文檔編號(hào)A61K38/25GK102399284SQ20101028638
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者劉維全, 劉芃芃, 王吉貴, 齊順章 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)