專利名稱：一株柵藻及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域,尤其涉及一種柵藻ENN34 (Scenedesmus sp.)及其應用。
背景技術(shù)：
隨著世界化石燃料儲備量的逐步耗竭，二氧化碳排放量的不斷增加以及全球氣候的日益趨暖，人類的生存和發(fā)展狀況已經(jīng)面臨前所未有的挑戰(zhàn)。因此，因此，世界各國都在積極尋找能夠替代石油產(chǎn)品的可再生能源，其中，生物柴油就是一種重要的生物能源，然而，常見的油料作物例如玉米和大豆等培育周期較長，占用農(nóng)田較多，會產(chǎn)生“與人爭糧，與糧爭地”問題，從而導致“解決了能源危機，卻出現(xiàn)糧食危機”的尷尬結(jié)果。微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛，營養(yǎng)豐富，生長周期短，光合利用度高的以光
合自養(yǎng)產(chǎn)生能量的低等植物，是自然界起源最早、分布最廣、種類和數(shù)量最大的生物質(zhì)資源。在一定條件下許多微藻能夠在細胞中大量積累儲藏性三酰甘油(微藻油)(類似于植物油)，其最高含量可達到細胞干重的50%以上。與高等陸生油料作物相比，微藻的單位面積油產(chǎn)量是油料植物油產(chǎn)量的數(shù)十倍，經(jīng)過生物冶煉可以生產(chǎn)生物柴油等多種生物燃料，被認為是最有可能最有潛力成為石油替代品的生物質(zhì)資源。除了油產(chǎn)量非常高之外，微藻還富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、各種氨基酸、維生素、抗生素、高不飽和脂肪酸以及其它多種生物活性物質(zhì)，因此，在保健食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域也同樣具有很好的開發(fā)前景。此外，微藻的環(huán)境適應能力非常強，對營養(yǎng)的要求也很簡單，可在各種嚴苛環(huán)境下生長。例如,微藻可通過光合作用吸收污水中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、磷酸鹽等無機鹽的氮磷合成氨基酸、蛋白質(zhì)、磷脂等有機物，形成微藻細胞，從而降低水體中的氮磷含量，因此微藻可用于去除污水中的氮磷。微藻還可利用工業(yè)廢氣中的CO2，減少CO2的排放。因此微藻在無論是工業(yè)環(huán)境保護方面還是城市環(huán)境保護方面也都有很好的應用前景。還有一些微藻可以生長在高鹽、高堿環(huán)境的水體中，可充分利用灘涂、鹽堿地、沙漠等不適宜進行耕種的土地進行大規(guī)模培養(yǎng)，也可利用海水、鹽堿水、工業(yè)廢水等非農(nóng)用水進行培養(yǎng)，被譽為可循環(huán)的“綠色油田”，因此發(fā)展微藻培養(yǎng)及其相關(guān)工業(yè)也非常適合土地尤其是耕地資源相對緊缺的我國。目前國內(nèi)外都積極開展了對于微藻的開發(fā)尤其是其在生物能源應用方面的開發(fā)，這其中以對小球藻的研究居多。CN101565675公開了一種小球藻及其培養(yǎng)方法和它在生物柴油生產(chǎn)中的應用；CN101824386公開了一株小球藻，及其在生產(chǎn)微藻油脂和固定CO2中的應用；CN102093955公開了一株小球藻及其在利用污水培養(yǎng)與生物柴油轉(zhuǎn)化體系中的應用；CN102229889公開了一株小球藻及其培養(yǎng)方法和在CO2的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白質(zhì)、色素、淀粉、多糖、核酸等生物質(zhì)的生產(chǎn)應用。柵藻是淡水中常見的浮游微藻，極喜在營養(yǎng)豐富的靜水中繁殖。許多種類對有機污染物具有較強的耐性，在水質(zhì)評價中可作為指示生物，并且在水體自凈和污水凈化中有一定作用，是有機污水氧化塘生物相中的優(yōu)勢種類。它可與細菌同時附著在水中有機物碎片和其他水生植物體上，形成膠質(zhì)層，吸附有機物。柵藻進行光合作用時，一方面產(chǎn)生氧氣供細菌分解有機質(zhì)的需要，另一方面還可直接利用有機質(zhì)作為碳源和氮源，使水中有機物迅速降解，從而凈化水體。柵藻細胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和維生素，是魚類很好的飼料，如利用有機污水氧化塘養(yǎng)魚，可獲高產(chǎn)。大量繁殖的藻體也可作家禽的飼料。目前國內(nèi)外對于柵藻的開發(fā)還不是很多，CN102083957公開了一種具有高效去除二氧化碳特征性的凸頭狀柵藻原變種微藻及其用途，尤其是二氧化碳固定率高的凸頭狀柵藻原變種微藻及其用途；CN102250773公開了一株柵藻及其培養(yǎng)方法和在CO2的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白質(zhì)、色素、淀粉、多糖、核酸等生物質(zhì)的生產(chǎn)等領(lǐng)域中的應用。盡管微藻具有非常良好的能源、環(huán)境保護甚至醫(yī)藥等開發(fā)前景，并且相關(guān)的研究工作也已經(jīng)逐漸展開，但是目前已知的微藻，尤其是柵藻，在油脂含量、對CO2的處理能力等方面的性能上還普遍偏低，因此需要有性能更好，更適于工業(yè)應用的柵藻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對環(huán)境適應能力強，油脂含量高，對CO2的處理能力強的更加適于工業(yè)應用的柵藻。為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案在第一方面,本發(fā)明提供了一種柵藻ENN34 (Scenedesmus sp.),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年07月13日，保藏號為CGMCC No. 6348。本發(fā)明提供的柵藻ENN34中脂肪酸在藻粉中的含量可以大于40%干重，優(yōu)選地大于50%干重，更優(yōu)選地為53°/Γ55%干重。。本發(fā)明提供的柵藻ΕΝΝ34可以含有O. 02%干重的蝦青素、O. 02%干重的β -胡蘿卜素、O. 003%干重的葉黃素、O. 08%干重的玉米黃質(zhì)和O. 03%干重的角黃素。在第二方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ34的培養(yǎng)方法，所述方法包括將柵藻藻株ENN 34綠色細胞接種在BGll培養(yǎng)基中，其中光照強度50-500umol/m2. s,優(yōu)選 100-450umol/m2. S、更優(yōu)選 150-400umol/m2. S、還更優(yōu)選 200-350umol/m2. S、最優(yōu)選250-300umol/m2. s，pH 值 7-9、優(yōu)選 7. 5-8. 5，更優(yōu)選 8，溫度 15-35°C、優(yōu)選 20_30°C、更優(yōu)選25。。。在本發(fā)明的柵藻ENN34的培養(yǎng)方法中，光照強度可以為50umol/m2. s、80umol/m2. s、100umol/m2· S、120umol/m2· s、150umol/m2· s、180umol/m2· s、200umol/m2· s、220umol/m2. s、250umol/m2· s、280umol/m2· s、300umol/m2· s、320umol/m2· s、350umol/m2· s、380umol/m2. s、400umol/m2· s、420umol/m2· s、450umol/m2· s、480umol/m2· s 或 500umol/m2. s ；pH 值可以為 7、7· 2、7· 5、7· 8、8、8. 2、8· 5、8· 8 或 9 ;溫度可以為 15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、21。。、22。。、23。。、24。。、25。。、26。。、27。。、28。。、29。。、30。。、31。。、32。。、33。。、34。?；?35。。。在第三方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的柵藻ENN34在脂肪酸生產(chǎn)中的應用，優(yōu)選地，所述脂肪酸是棕櫚酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α -亞麻酸、Y -亞麻酸和/或二十碳五烯酸。在第四方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ34在生物燃料生產(chǎn)中的應用，優(yōu)選地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
在第五方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的柵藻ENN34在環(huán)境保護中的應用，優(yōu)選地所述環(huán)境保護為污水處理或CO2減排，所述污水處理包括污水的脫氮、除磷、有機物降解和/或重金屬離子吸附。在第六方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的柵藻ENN34在包含棕櫚酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、蝦青素、β_胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和/或角黃素的藥物制備中的應用。在第七方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ34在包含棕櫚酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、蝦青素、β_胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和/或角黃素的食品、保健品、飼料和/或水產(chǎn)品餌料生產(chǎn)中的應用。在第八方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ34在包含棕櫚酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、蝦青 素、β -胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和/或角黃素的化工產(chǎn)品生產(chǎn)中的應用，優(yōu)選地所述化工產(chǎn)品是色素或化妝品。在本發(fā)明中，BGll培養(yǎng)基為本領(lǐng)域中最常用的藻類培養(yǎng)基，其具體組分見下文。本發(fā)明的有益技術(shù)效果為I、本藻種生長速度快，CO2利用率高，且細胞沉降性好，便于收集，適宜于高密度養(yǎng)殖，適合產(chǎn)業(yè)化推廣2、本藻種油脂積累快，含油量高，適合用來生產(chǎn)生物柴油3、本藻種能有效去除水中的氮，適宜用于廢水處理4、本藻種經(jīng)誘導后，細胞呈現(xiàn)紅色，含有部分有益的色素，適合用于生產(chǎn)飼料。


圖I是本發(fā)明的柵藻ΕΝΝ34在顯微鏡下的鏡檢圖片。圖2顯示本發(fā)明的柵藻ΕΝΝ34的18S序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對的結(jié)果。圖3是采用鄰位相連(Neighbor-joining)算法構(gòu)建的柵藻ENN34的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。圖4是本發(fā)明的柵藻ENN34的室內(nèi)培養(yǎng)生長曲線。圖5是本發(fā)明的柵藻ENN34中所含色素的色譜圖。圖6是表示本發(fā)明的柵藻ENN34中各色素的含量的柱形圖。圖7是本發(fā)明的柵藻ENN34的室外培養(yǎng)生長曲線。圖8是顯示本發(fā)明的柵藻ENN34對培養(yǎng)基中氮的消耗的曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖并通過具體實施方式
來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例I篩選產(chǎn)油柵藻藻株在云南滇池中取水樣，加入1/3體積的BGll培養(yǎng)基，在25 °C、光照強度為40ymol/m2. s的條件下培養(yǎng)5天左右，取該水樣于顯微鏡下觀察，判斷水樣中存在的主要物種。調(diào)整細胞濃度約為1000個/ml，取100 μ I水樣涂布于BGll培養(yǎng)基的固體瓊脂板上，在25°C、光照強度為40ymOl/m2. s左右的條件下培養(yǎng)10天左右，即可看到單藻落長出，用接種環(huán)或無菌牙簽挑取單藻落接種于BGll培養(yǎng)基中培養(yǎng)。重復此過程，直到獲得純培養(yǎng)的藻株，本發(fā)明中對其編號稱為“ΕΝΝ34”。實施例2鑒定藻種及其在進化樹上的分類。藻株鑒定采取形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合的方法。I.形態(tài)鑒定(見圖I):對上述分離出的藻株ΕΝΝ34在1000倍鏡下進行觀察，細胞為球形，大小6-10um，色素體周生，一個蛋白核，無性生殖產(chǎn)生似親孢子。初步鑒定為柵藻。2.分子鑒定A，從分離的藻擴增其18S核苷酸序列
用CTAB法提取培養(yǎng)4天的ENN 34藻基因組DNA。取一定量的細胞，研磨處理后加入適量CTAB緩沖液，勻漿，加入等體積的酚氯仿抽提，等體積異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后溶于一定體積滅菌雙蒸水中，紫外分光光度計檢測其濃度和純度。18S序列擴增采用真核生物18S擴增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公司合成)。引物15，CCTGGTTGATCCTGCCAG 3，(SEQ ID NO: I)引物25，TTGATCCTTCTGCAGGTTCA3，(SEQ ID NO:2)取I μ I總DNA為模板。擴增條件如下94°C變性5min，然后94°C 40s, 56°C 40s，72°C 2min 30個循環(huán)，最后72°C IOmin0 I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增產(chǎn)物，PCR擴增獲得約1700bp片斷。序列如下(下劃線部分為引物序列)CCTGGTTGATCCTGCCAGCTATGTCGACTTCTCTTCTCTAGGTGGGAGGGTTTA ATGAACTTCTCGGCAGACCTGAGGTGTTGCCACCCTAAGCTGCCAATCCGAACACTT CACCAGCACACCCAATCGGTAGGAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGT AATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGACTAATAA TTGCAATAATCTATCCCCATCACGATGCAGTTTCAAAGATTACCCAGACCCTTCGGT CAAGGATAGGCTTGTTGAATGCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAA GGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCATACTTCCATTGACTAAACGCCAATAGTCCC TCTAAGAAGTCAGCCAGCTGCAAAAAGCAACAGAGACTATTTAGCAGGCTGAGGTCT CGTTCGTTACCGGAATCAACCTGACAAGGCAACCCACCAACTAAGAACGGCCATGCA CCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCACTATGTCTGG ACCTGGTAAGTTTTCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTGGTGG TGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACC CAAAAACTTTGATTTCTCATAAGGTGCTGGCGAAGTCATTGAAAAAACATTCGCCAA TCCCTAGTCGGCATCGTTTATGGTTGAGACTACGACGGTATCTAATCGTCTTCGAGC CCCCAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGT TCGTCTTTCATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATGAAATACGAATGCCCCCGA CTGTCCCTCTTAATCATTACTCCGGTCCTACAGACCAACAAGATAGGCCAGAGTCCT ATCGTGTTATTCCATGCTAAAGTATTCTGGCGTAAGCCTGCTTTGAACACTCTAATT TACTCAAAGTAACCACGTCGACTCCGAGTCCCGGACAGTGAAGCCCAGAAGCCCGTC CCCGACAGAAAGGAAGGCCATAGCAGTACTCACCATAGGCGGACCGCTAGAACCCAC CCGAAATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTAAATATACGCTATTGGAGC TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATGGATCCTCGTTAAGGG ATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACCAGACATGAAATGCCCGGTATTGTTATTTAT TGTCACTACCTCCCCGTATCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGG ATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATCCTCCGTCAC CCGTTACCACCATGGTAGGCCTCTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATT TGAATGGAACAGCGCCGGCACAAGGCCATGCGCTTCGTGAAGATATCATGATTCACC GCGGGTCGAGCAAAGCTCGGTCGGCCTTTTATCTAATATATACGTCCCTTCCAGAAG TCGGGATTTACGCACGTATTAGCTCTAGAATTACTACGGTTATCCGAGTAGTAAGGT ACCACCAAATAAACTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAGC AGTTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGACTACTGGCA GTCCAAACCCTGAACCTGCAGAAGGATCAA (SEQ ID NO:3)。B，對所克隆的核苷酸序列進行同源性搜索將獲得的ENN 34的18S序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，結(jié)果顯示與登錄號為X74002. I的Scenedesmus rubescens的18S小亞基rRNA的基因序列最為相似，匹配度為99%，覆蓋率為99% (圖2)。 C，根據(jù)上述序列作出進化樹。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具對藻株ENN 34的18S部分序列進行序列相似性分析。選取部分同源序列和該藻株的18S部分序列利用clustaLx軟件包進行序列同源進化比對，形成一個多重序列匹配排列矩陣。然后，運用Mega4. O軟件，采用鄰位相連算法，自展數(shù)據(jù)集bootstraps值為1000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,見圖3。根據(jù)18Sblast的結(jié)果，限定ENN34為柵藻屬(Scenedesmus)發(fā)明人已將所述藻株于于2012年7月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，簡稱CGMCC)，其保藏編號為CGMCCNO. 6348。實例3 ENN34藻的室內(nèi)養(yǎng)殖、油脂積累及色素分析將處在對數(shù)生長期的柵藻藻株ENN 34綠色細胞接種在配制好的BGll培養(yǎng)基(配方見表I)中，使細胞密度達到0D750為O. 2-0. 8之間。培養(yǎng)過程光照強度控制在50-500umol/m2. s，在培養(yǎng)期內(nèi)，通過向培養(yǎng)液中通入I. 5-2%的二氧化碳和空氣的混合氣體，將培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)在7-9之間，溫度調(diào)控在15-35°C范圍內(nèi)。培養(yǎng)所使用的反應器為40_內(nèi)徑、長度600_的柱式反應器。培養(yǎng)過程中，定時取樣測定干重，結(jié)果見圖4。培養(yǎng)進行到第16天，藻液顏色變紅時，將藻液收集，通過離心或自然沉降的方法獲得藻泥，將藻泥在進行真空冷凍干燥。表I BGll培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1.一種柵藻ENN34(Scenedesmus sp.),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年07月13日，保藏號為CGMCC No. 6348。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柵藻ENN34，其特征在于，所述柵藻ENN34中脂肪酸的含量為大于40%干重，優(yōu)選地大于50%干重，更優(yōu)選地為53°/Γ60%干重。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柵藻ΕΝΝ34，其特征在于，所述柵藻ΕΝΝ34含有O.02%-0. 1%干重的蝦青素、O. 02-0. 1%干重的β -胡蘿卜素、O. 003-0. 01%干重的葉黃素、O. 08-0. 2%干重的玉米黃質(zhì)和O. 03-0. 1%干重的角黃素。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的柵藻ΕΝΝ34的培養(yǎng)方法，所述方法包括將柵藻藻株ΕΝΝ34綠色細胞接種在BGlI培養(yǎng)基中，其中光照強度50-500umol/m2. s,優(yōu)選 100-450umol/m2. S、更優(yōu)選 150-400umol/m2. S、還更優(yōu)選 200-350umol/m2. S、最優(yōu)選250-300umol/m2. s，pH 值 7-9、優(yōu)選 7. 5-8. 5，更優(yōu)選 8，溫度 15-35°C、優(yōu)選 20_30°C、更優(yōu)選25。。。
5.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的柵藻ENN34在脂肪酸生產(chǎn)中的應用，優(yōu)選地，所述脂肪酸是棕櫚酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸和/或二十碳五烯酸。
6.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的柵藻ΕΝΝ34在生物燃料生產(chǎn)中的應用，優(yōu)選地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
7.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的柵藻ΕΝΝ34在環(huán)境保護中的應用，優(yōu)選地所述環(huán)境保護為污水處理或CO2減排，所述污水處理包括污水的脫氮、除磷、有機物降解和/或重金屬離子吸附。
8.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的柵藻ΕΝΝ34在包含棕櫚酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和/或角黃素的藥物的制備中的應用。
9.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的柵藻ΕΝΝ34在包含棕櫚酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和/或角黃素的食品、保健品和/或飼料生產(chǎn)中的應用。
10.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的柵藻ΕΝΝ34在包含棕櫚酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和/或角黃素的化工產(chǎn)品生產(chǎn)中的應用，優(yōu)選地所述化工產(chǎn)品是色素或化妝品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株柵藻(Scenedesmus sp.)及其應用，本發(fā)明的柵藻具有生長速度快、油脂積累快、含油量高、能夠有效去除水中的含氮化合物等優(yōu)點，并且含有適合部分有益的色素，可用于生物柴油生產(chǎn)，食品、保健品、飼料、水產(chǎn)品餌料生產(chǎn)以及化妝品和色素產(chǎn)品等化工產(chǎn)品的生產(chǎn)。
文檔編號A61K8/97GK102943044SQ201210320220
公開日2013年2月27日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者羅少敬, 黃龍耀, 馬建源, 吳洪, 鄧平 申請人:新奧科技發(fā)展有限公司