專利名稱：一種篩選抗細(xì)菌粘附抑制劑的方法和抗粘附口服液的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選抗細(xì)菌粘附抑制劑的新方法和一種抗細(xì)菌粘附口服液的制備。
背景技術(shù)：
抗生素為治療和預(yù)防細(xì)菌感染做出了重大貢獻(xiàn)，但是由于抗生素的廣泛使用(包括濫用)，細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大問題?，F(xiàn)有抗菌藥物的特征是破壞細(xì)菌的生命功能，如干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、破壞細(xì)菌DNA的復(fù)制或蛋白質(zhì)的合成等， 正是這些作用機(jī)制的選擇壓力，促進(jìn)了耐藥菌株的出現(xiàn)。為解決細(xì)菌的耐藥性問題，一種新的抗菌藥物研發(fā)思路逐漸形成，即研究以抑制細(xì)菌毒力因子或阻斷細(xì)菌與宿主細(xì)胞的聯(lián)系為作用機(jī)制的新型抗菌藥物。
細(xì)菌都能表達(dá)粘附素(adhesin)，環(huán)境中的大部分細(xì)菌都能粘附到一定界面而形成固定群落。粘附素有兩類，即菌毛(pili，fimbriae)和非菌毛粘附物質(zhì)(afimbrial adhesin)。病原菌粘附到宿主細(xì)胞表面是細(xì)菌感染的關(guān)鍵步驟，比如呼吸道、泌尿道、消化道的細(xì)菌感染都涉及粘附問題。此外，在細(xì)菌形成生物膜(biof iIm)的初期，細(xì)菌粘附起重要作用。細(xì)菌生物膜能保護(hù)細(xì)菌逃避機(jī)體的免疫應(yīng)答、屏蔽抗菌藥物、削弱機(jī)體內(nèi)部流體剪切力對細(xì)菌的作用，并引起二次感染。因此，細(xì)菌粘附抑制劑的研究近年來受到廣泛關(guān)注。、
目前篩選細(xì)菌粘附抑制劑的方法主要采用結(jié)晶紫染色比色法，具體方法如下將細(xì)菌接種在含液體培養(yǎng)基的96孔板中，試驗(yàn)樣本加入液體培養(yǎng)基中，不加樣本的做陰性對照，培養(yǎng)一定時間后，漂洗培養(yǎng)板，去除懸浮細(xì)菌，自然干燥，往板孔內(nèi)加入結(jié)晶紫溶液，再洗去結(jié)晶紫溶液，然后加入一定量甲醇溶液，在540nm測定吸光值，吸光值越大表明粘附在孔表面的細(xì)菌越多，抗細(xì)菌粘附抑制劑能防止細(xì)菌粘附，因此，被篩選樣本如果有抑制細(xì)菌粘附的作用，則吸光值小。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能一次完成多個樣本的篩選，缺點(diǎn)是可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因?yàn)橐恍颖咀陨砜杀豢妆砻嫖剑⒛鼙唤Y(jié)晶紫著色，顯示的吸光值并不是因細(xì)菌粘附形成的。發(fā)現(xiàn)更客觀的方法對篩選抗細(xì)菌粘附抑制劑具有重大意義。
盡管對細(xì)菌的粘附現(xiàn)象及其危害已經(jīng)取的較大進(jìn)展，但是迄今為止，沒有一種抗細(xì)菌粘附抑制劑進(jìn)入臨床，目前，對細(xì)菌引起的消化道、呼吸道、泌尿道感染的治療依然依賴大劑量給予抗生素的策略，加劇了耐藥菌的出現(xiàn)和二次感染的發(fā)生。所以發(fā)現(xiàn)具有抗細(xì)菌粘附的制劑具有重要的社會價值和經(jīng)濟(jì)利益。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是制備抗細(xì)菌粘附的口服液。
本發(fā)明的另外一個目的是克服傳統(tǒng)方法在篩選抗細(xì)菌粘附抑制劑時可能導(dǎo)致假陰性的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種能直觀判斷被篩選樣本是否具有抗細(xì)菌粘附的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種抗細(xì)菌粘附口服液，配方包含冷水花40克、金銀花60克和茯苓100克，并制成口服液。
—種抗細(xì)菌粘附口服液的制備方法，冷水花、金銀花混合，水煎煮3次，合并煮液， 濃縮后干燥，得到混合水提取A ;茯苓用水煎煮，煮液冷卻后過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，萃取物回收乙酸乙酯后干燥，得到淺黃色干粉B ;取10克的混合水提取A和2克干粉B，加入 IOOml自來水中，加熱溶解后滅菌，冷卻后加入Iml的紅茶菌菌液，置30°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 7-9天，待pH值降到4時，停止發(fā)酵，過濾得到發(fā)酵液，發(fā)酵液冷凍處理48小時，解凍后高速離心除菌，上清液無菌罐裝，置4°C冰箱保存。
一種篩選抗細(xì)菌粘附抑制劑的方法，將滅菌的普通肉湯加入無菌培養(yǎng)皿中，放入一張五邊形的無菌載玻片，載玻片的一端浸入肉湯中，另一端架在培養(yǎng)皿邊緣上，先加入滅菌上述上清液，再加入細(xì)菌懸液，陰性對照不加樣本溶液；將培養(yǎng)皿置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 小時，然后，取出載玻片，在無菌水中漂洗，將接觸肉湯一面火焰固定，結(jié)晶紫染色，置顯微鏡下觀察，導(dǎo)出圖像。
本發(fā)明達(dá)到的有益效果本發(fā)明制備的抗細(xì)菌粘附口服液能抑制大腸桿菌的粘附，最小有效濃度為1% (VA)0 小鼠實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液能終止腸炎沙門氏菌、大腸桿菌的人工感染，能有效治療兔尿道大腸桿菌的人工感染。志愿者試驗(yàn)表明，本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液具有抗腸道感染、尿道感染的作用，還具有治療感冒的藥效。
水提取A和干粉B在水中加熱溶解后，口感不佳，用紅茶菌發(fā)酵后，口味以酸為主， 口感得到提高。
本發(fā)明能直觀顯示細(xì)菌粘附的圖像，直觀判斷被篩選樣本是否抗細(xì)菌粘附。
本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液志愿者口服治療效果 案例一，彭某，男，49歲，貴州大學(xué)教師，長期胃腸道不適，腹灣，口服本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液10毫升，僅服用3次，腹瀉停止，消化功能正常，體況變好。
案例二，田某，男，34歲，貴州大學(xué)教師，感冒不適，咽喉腫痛，口服本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液20毫升，僅服用I次即痊愈。
案例三，楊某，男，17歲，中學(xué)生，因吃烤肉，上吐下瀉，口服本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液10毫升，僅服用I次即痊愈。
案例四，楊某，男，49歲，貴州大學(xué)教師，尿道感染，排尿有燒妁感，尿頻，口服本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液20毫升，僅服用I次即痊愈。
案例五，楊某，53歲，公務(wù)員，長期飲酒，胃腸不適多年，口服本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液10毫升，服用73次，消化功能正常，體況變好。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I:本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液的制備一、材料與方法(I)材料冷水花根莖采自貴陽市雷打巖峽谷、金銀花采自貴陽市情人谷、茯苓購自貴州省黎平縣九潮鄉(xiāng)。冷水花根莖切碎后陰干，金銀花陰干，茯苓去皮后切成丁或片，陰干備用。紅茶菌購自湖南岳陽市紅茶菌培育研究中心。
(2)方法冷水花干燥頸根400克、金銀花600克，加水6升分三次煎煮，得到濾液 4升，濃縮得到浸膏，浸膏置水浴蒸干，得到水提物A80克。茯苓1000克用水4升分三次煎煮，得到濾液2升，靜置過夜，虹吸得到上清液I. 8升，用乙酸乙酯萃取，萃取液回收后干燥得到淺黃色干粉B20克。取10克的水提取A和2克干粉B，加入IOOml自來水中，加熱溶解后滅菌，冷卻后加入Iml的紅茶菌菌液，置30°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7天左右，待pH值降到4 時，停止發(fā)酵，過濾得到發(fā)酵液80ml。發(fā)酵液置三角燒瓶_20°C冰箱放置48小時后，室溫解凍，解凍液離心(4000轉(zhuǎn)/分)10分鐘，收集上清液(60ml )，置三角燒瓶用硅膠塞加蓋，0-4°C 冰箱保存，即為本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液。定期(7、15、30、60日)檢測pH值、細(xì)菌總數(shù)、 霉菌總數(shù)、大腸桿菌數(shù)。
二、結(jié)果本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液為棕紅色液體，口味酸、微苦。pH值、細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)、 大腸桿菌數(shù)檢測見表I。
權(quán)利要求
1.一種抗細(xì)菌粘附口服液，其特征在于配方包含冷水花40克、金銀花60克和茯苓100克，并制成口服液。
2.如權(quán)利要求I所述的一種抗細(xì)菌粘附口服液的制備方法，其特征在于冷水花、金銀花混合，水煎煮3次，合并煮液，濃縮后干燥，得到混合水提取A ;茯苓用水煎煮，煮液冷卻后過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，萃取物回收乙酸乙酯后干燥，得到淺黃色干粉B ;取10克的混合水提取A和2克干粉B，加入IOOml自來水中，加熱溶解后滅菌，冷卻后加入Iml的紅茶菌菌液，置30°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7-9天，待pH值降到4時，停止發(fā)酵，過濾得到發(fā)酵液，發(fā)酵液冷凍處理48小時，解凍后高速離心除菌，上清液無菌罐裝，置4°C冰箱保存。
3.一種篩選抗細(xì)菌粘附抑制劑的方法，其特征在于將滅菌的普通肉湯加入無菌培養(yǎng)皿中，放入一張五邊形的無菌載玻片，載玻片的一端浸入肉湯中，另一端架在培養(yǎng)皿邊緣上，先加入滅菌上述上清液，再加入細(xì)菌懸液，陰性對照不加樣本溶液；將培養(yǎng)皿置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，然后，取出載玻片，在無菌水中漂洗，將接觸肉湯一面火焰固定，結(jié)晶紫染色，置顯微鏡下觀察，導(dǎo)出圖像。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選抗細(xì)菌粘附抑制劑的新方法和一種本發(fā)明的抗細(xì)菌粘附口服液的制備，本發(fā)明所述的新方法為使用特殊形狀的載玻片浸入液體培養(yǎng)基中供細(xì)菌粘附，培養(yǎng)基中加入被篩選樣本，通過顯微圖像分析判斷抗細(xì)菌粘附藥效；本發(fā)明涉及的抗細(xì)菌粘附口服液的原料為冷水花、金銀花和茯苓，經(jīng)過提取、配液、發(fā)酵、冷凍、離心工藝制備，具有抗細(xì)菌粘附、抗腸道、尿道感染和抗感冒的藥效。
文檔編號A61P31/04GK102973633SQ201210581948
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者楊再昌, 杜潤孜, 陸倫維, 楊小生 申請人:貴州大學(xué)