專利名稱：與凋亡或壞死相關的TNFα短肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學領域，更具體地涉及引起細胞凋亡和壞死的腫瘤壞死因子TNF-a激動劑多肽及其制法和用途。
背景技術：
TNF-a是一種多功能的細胞因子，可由多種細胞分泌，其中最主要是來自巨噬細胞。TNF-a通過與靶細胞受體TNFR結合發(fā)揮多種生理功能，例如引起惡病質、刺激淋巴細胞生長、誘發(fā)炎癥反應、誘導細胞凋亡和壞死性死亡。TNF-a是以三聚體的形式與它的受體三聚體結合。然而，人們并不知道TNF-a與受體結合后為什么會引起以及如何引起不同的的功能，有時甚至是引起相反的功能。 有研究顯示，TNF-a在低pH環(huán)境下會產生結構上的變化，然后插入細胞膜，從而促使細胞發(fā)生裂解[Proc. Natl. Acad. Sci. 1996 ;USA 93:1021-1026]。這一結果提示TNF- a結構的改變可能是它發(fā)揮功能的關鍵。此外，受體TNFR存在兩種形式，但是TNFR2受體只有存在于人體的某些細胞里，因此無法以此解釋為什么TNF-a與受體結合會引起的不同功能。這些未解之謎對TNF-a的臨床應用造成了一定影響。因此，本領域迫切需要確定導致TNF-a不同功能的原因，并開發(fā)具有明確功能的TNF-a或其衍生多肽。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種鑒定引起細胞凋亡和/或壞死的腫瘤壞死因子TNF-a激動劑多肽的方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述能引起細胞凋亡和/或壞死的腫瘤壞死因子TNF-a激動劑多肽及其制法和用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種鑒別引起細胞凋亡和/或細胞壞死的腫瘤壞死因子TNF-a激動劑多肽的方法，包括步驟(a)提供基于腫瘤壞死因子TNF-a的多肽，所述多肽的長度為7_50個氨基酸；(b)測定所述多肽引起細胞凋亡的能力和測試所述多肽引起細胞壞死的能力，如果所述多肽能夠明顯引起細胞凋亡且引起凋亡的程度遠大于引起壞死的程度，則該多肽是引起細胞凋亡的TNF-a激動劑多肽；如果所述多肽能夠明顯引起細胞壞死且引起壞死的程度遠大于引起凋亡的程度，則該多肽是引起細胞壞死的TNF-a激動劑多肽。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，如果所述多肽能夠明顯引起細胞胞內表達caspase-3但沒有細胞膜破壞,而且這種(Caspase-3陽性,細胞膜破壞陰性)細胞的百分比超過陰性對照中同樣細胞20%以上，則該多肽是引起早期細胞凋亡的TNF-a激動劑多肽；如果所述多肽既能夠明顯引起細胞胞內表達caspase-3又能引起細胞膜破壞，而且這種(Caspase-3陽性，細胞膜破壞陽性)細胞的百分比超過陰性對照中同樣細胞20%以上，則該多肽是引起晚期細胞凋亡的TNF-a激動劑多肽；如果所述多肽不激活胞內caspase-3的表達但卻能夠明顯引起細胞膜破壞，而且這種細胞(caspase-3陰性，細胞膜破壞陽性)的百分比超過陰性對照中同樣細胞20%以上，則該多肽是引起細胞壞死的TNF-a激動劑多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的陰性對照是在不添加所述的待測多肽的情況下，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的相同種類的細胞。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，當該多肽滿足以下條件時，則該多肽是TNF-a的細胞凋亡型激動劑多肽⑴該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%，更佳地彡50%，最佳地彡70% )細胞表達caspase-3或發(fā)生凋亡；(ii)設Zl = Q1-Q2，則Zl彡20%，其中Ql為在相同條件下，該多肽引起的胞內caspase-3表達(發(fā)生凋亡)的細胞百分比數(shù)量，而Q2為無多肽(或陰性多肽)引起胞內表 達caspase-3的細胞百分比數(shù)量。較佳地，Zl彡30%，更佳地Zl彡50%;最佳地Zl彡70 %。在另一優(yōu)選例中，還包括根據(jù)以下條件，進一步細分凋亡型激動劑的類型(iii)設Z2 = Q3-Q4，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細胞百分比數(shù)量，而Q4為無多肽(或陰性多肽)引起的細胞膜破壞數(shù)量(百分比)；當21彡20%，Z2 ( 5%，判定為早期細胞凋亡；當Zl彡20%, Z2彡20%，判定為晚期細胞凋亡。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，當該多肽滿足以下條件時，則該多肽是TNF-a的細胞壞死型激動劑多肽(i)在無caspase-3胞內表達的條件下,該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%,更佳地> 50%，最佳地> 70% )細胞膜破壞(細胞壞死)；(ii)當無細胞凋亡或Zl 5% (如0% )，設Z2 = Q3-Q4，則Z2彡20%，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細胞百分比數(shù)量，而Q4為無多肽(或陰性多肽)引起的細胞細胞膜破壞的細胞百分比數(shù)量。(較佳地，Z2彡30%，更佳地Z2彡50% ；最佳地Z2彡70%。)在另一優(yōu)選例中，所述的多肽的序列來源于人TNF-a，更佳地來源于SEQ ID NO.I (或參見 uniprot/P01375)。在另一優(yōu)選例中，所述多肽的長度為8-40個氨基酸，更佳地9-30個氨基酸，最佳地10-20個氨基酸。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種TNF-a的激動劑多肽，所述的多肽具有以下特征(i)該多肽的序列來源于腫瘤壞死因子TNF-a的氨基酸序列；(ii)該多肽的長度為7-50個氨基酸；(iii)該多肽具有明顯引起細胞凋亡或明顯引起細胞壞死的能力。在另一優(yōu)選例中，被誘導凋亡或被誘導細胞壞死的細胞包括腫瘤細胞、過度增長的細胞包括與自身免疫相關的細胞(如自身免疫T細胞、B細胞)。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細胞凋亡型激動劑多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞凋亡型激動劑多肽含有或具有選自下組的序列SEQID NO. :3(P8)、6 (Pll)、7(P12)、8(P13)、15 (P20)和 16(P21)。
在另一優(yōu)選例中，所述的細胞凋亡型激動劑多肽包括？8、？11、？12、？13、？20、？21、P13-2、P13-3、P13-4、P13-5、P13—6、P13—7、P13—8、P13—9、P13—10、P16—6、P16—7、P16—8、P16-9、P16-10、P16-11 或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細胞壞死型激動劑多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞壞死型激動劑多肽含有或具有選自下組的序列SEQID NO. :9(P14)、10(P15)JP11(P16)。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞壞死型激動劑多肽包括P14、P15、P16、P13-10、P14-1、P14-2、P14-3、P14-4、P16-5 或其組合。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學上可接受的載體和本發(fā)明第二方面中所述的TNF-a的激動劑多肽。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第二方面中所述的TNF-a的激動劑多肽的 用途，它被用于制備誘導細胞凋亡和/或壞死的藥物組合物。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第二方面中所述的TNF-a的激動劑多肽的用途，它被用于制備治療腫瘤的藥物組合物；或用于制備治療自身免疫病及感染性疾病的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括口腔癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、結腸癌、肛門癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、壺腹癌、鼻咽癌、肺癌、皮膚癌(黑色素瘤)、骨癌、骨髓癌、T及B細胞淋巴瘤、白血病、何杰金氏瘤、非何杰金氏瘤、卡波氏肉瘤、頭頸部腫瘤、腦瘤、神經膠質瘤、甲狀腺癌、胸腺癌、腎癌、輸尿管癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌、陰莖癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、輸卵管癌、陰道癌。在另一優(yōu)選例中，所述的感染性疾病包括HIV感染。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種體外(非治療性)誘導細胞凋亡和/或細胞壞死的方法，包括步驟在本發(fā)明第二方面所述的TNF-a的激動劑多肽存在下，培養(yǎng)細胞，從而誘導細胞凋亡和/或細胞壞死。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種誘導對象發(fā)生細胞凋亡和/或細胞壞死的方法，包括步驟給需要治療的對象施用第二方面所述的TNF-a的激動劑多肽，從而誘導細胞凋亡和/或細胞壞死。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種減少或封閉對象發(fā)生TNF-a相關炎癥的方法，包括步驟給需要治療的對象施用第二方面所述的TNF- a的激動劑多肽，從而誘導細胞凋亡和/或細胞壞死。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細胞凋亡型激動劑多肽(包括P12和P13)。在本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療感染性疾病的方法，其特征在于，包括步驟給需要治療的對象施用第二方面所述的TNF-a的激動劑多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的感染性疾病是HIV感染。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細胞凋亡型激動劑多肽(包括P12和P13)。在本發(fā)明的第十方面，提供了一種第二方面所述的TNF-a的激動劑多肽的用途，它被用于制備提高體重的藥物組合物。在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種提高治療對象體重的方法，包括步驟給需要的對象施用第二方面所述的TNF-a的激動劑多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的對象是腫瘤患者。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細胞凋亡型激動劑多肽(包括P12)、細胞凋亡型激動劑多肽(包括P16)、或其組合。應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再
累述。


圖Ia顯示了完整TNF-a不能誘導T細胞死亡。圖Ib顯示了 TNF- a激活NF_kB (細胞生長)?！?br> 圖Ic顯示了 TNF- a片段(多肽)可誘導細胞凋亡和壞死。圖Id顯示了各NF-多肽(20aa)誘導之細胞凋亡和壞死的圖譜。圖Ie顯示了 TNF-a (IOaa)多肽誘導之細胞凋亡和壞死的圖譜。圖If顯示了 TNF- a多肽誘導之新鮮或經PHA刺激過的PBMC凋亡情況。圖Ig顯示了 TNF- a多肽誘導之新鮮或經PHA刺激過的PBMC壞死情況。圖2顯示了 TNF- a結合可溶性的TNF受體。圖3a顯示了 P12和pl3抑制TNF-a的殺傷作用。圖313顯示了？12和？13可抑制丁,-0的殺傷作用。圖3c顯示了 Anti_P12抗體抑制TNF-a的殺傷作用。其中，縱坐標為細胞數(shù)，橫坐標為caspase-3表達量。空峰為陰性對照(就是無TNF- a，只有L929細胞)，因此無細胞凋亡(無caspase-3表達)。TNF-a加L929細胞后會引起細胞凋亡。黑峰表示細胞表達caspase-3，細胞凋亡。右圖表明加對照血清對TNF-a殺L929細胞沒影響。左圖表示加了抗P12抗體后，抑制了 TNF-a引起的L929凋亡，黑峰左移，細胞凋亡減少?！癐”和“2”是分別來源于兩只老鼠的抗血清。TNF-a的濃度是0. 59nM。圖4a顯示了 HIV感染導致MT2細胞死亡。圖4b顯示了 HIV感染導致MT2細胞死亡的曲線。圖4c顯示了 HIV感染或不感染的MT2細胞，在未經P13或P16處理下細胞凋亡和壞死的情況。圖4d顯示了 HIV感染或不感染的MT2細胞，經P13和P16處理后細胞凋亡和壞死的情況。圖4e用柱形圖總結圖4c的結果。圖4f用柱形圖總結圖4d的結果。圖4g顯示了隨著P13濃度的增加，HIV感染逐漸減少。圖4h顯示了使用P13和P16時，HIV感染細胞的數(shù)量圖。圖4i顯示了細胞凋亡激動劑多肽P12和P13可以使上清液中的病毒含量減少。圖5顯示了 P16對多種腫瘤細胞的殺傷作用。圖6顯示了肽P12和P16對老鼠體重的影響。
具體實施方式
本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)和證實了，完整的TNF-a可以刺激細胞生長，不會誘導細胞死亡，但是變性的TNF- a (如降低TNF- a溶液的pH值所導致的變性、酶降解所導致的變性)、片段化的TNF-a多肽卻能誘導細胞凋亡和/或壞死。這一發(fā)現(xiàn)對于治療炎癥、感染和腫瘤具有極重要的應用價值。在此基礎上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體地，完整的TNF- a能刺激一些正常的細胞(如PBMC)和其它許多細胞株的生長(如Jurkat A3和MT2細胞)，但是很少會引起這些細胞的凋亡或壞死。完整的TNF-a也能引起一些腫瘤細胞(如L929和U937細胞)的死亡、凋亡及壞死。然而，一些TNF-a衍生多肽分別具有明顯的誘導細胞凋亡和/或細胞壞死的功能。本發(fā)明不僅提供了定量鑒定細胞凋亡與壞死的方法(并以TNF-a為例子)，而且除TNF-a外，該方法還可以用于藥物(如小分子藥物及生物藥物)毒性的篩選。術語
如本文所用，術語“TNF-a ”和“腫瘤壞死因子a ”可互換使用，指哺乳動物(包括人)的腫瘤壞死因子a。優(yōu)選的TNF-a來源于人，野生型人TNF-a蛋白具有233個氨基酸，序列見 http://www. uniprot. org/uniprot/P01375 或 SEQ ID NO. :1。應理解，該術語也包括天然存在的、上述野生型人TNF-a的突變體。本發(fā)明多肽在本發(fā)明中，術語“本發(fā)明的短肽”、“本發(fā)明的多肽”或“TNF-a衍生多肽”可互換使用，指衍生自TNF-a序列的、具有確定的引起細胞凋亡和/或細胞壞死功能的多肽。通常，這些斷短肽的長度為7-50個氨基酸，較佳地8-40個氨基酸，更佳地9-30個氨基酸，最佳地10-20個氨基酸。應理解，本發(fā)明的短肽通常包括兩類多肽，即“TNF-a的細胞凋亡型激動劑多肽”和“TNF-a的細胞壞死型激動劑多肽”。在本發(fā)明中，當TNF-a及某一多肽滿足以下條件時，可認為是TNF-a的細胞凋亡型激動劑多肽⑴該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%，更佳地彡50%，最佳地彡70% )細胞表達caspase-3或發(fā)生凋亡；(ii)設Zl = Q1-Q2，則Zl彡20%，其中Ql為在相同條件下，該多肽引起的胞內caspase-3表達(發(fā)生凋亡)的細胞百分比數(shù)量，而Q2為無多肽(或陰性多肽)引起胞內表達caspase-3的細胞百分比數(shù)量。較佳地，Zl彡30%，更佳地Zl彡50%;最佳地Zl彡70 %。此外，可進一步基于(iii)進行細分(iii)設Z2 = Q3-Q4，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細胞百分比數(shù)量，而Q4為無多肽(或陰性多肽)引起的細胞膜破壞數(shù)量(百分比)。當Zl彡20%，Z2 ( 5%，為早期細胞凋亡；當Zl彡20%, Z2彡20%，為晚期細胞凋亡。在步驟(b)中，當該多肽滿足以下條件時，則該多肽是TNF-a的細胞壞死型激動劑多肽(i)在無caspase-3胞內表達的條件下,該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%,更佳地> 50%，最佳地> 70% )細胞膜破壞(細胞壞死)；(ii)當無細胞凋亡或Zl =彡5% (如0% )，設Z2 = Q3-Q4，則Z2彡20%，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細胞百分比數(shù)量，而Q4為無多肽(或陰性多肽)引起的細胞細胞膜破壞的細胞百分比數(shù)量。則該多肽是引起細胞壞死的TNF-a激動劑多肽。較佳地，Z2彡30%，更佳地Z2 ^ 50% ;最佳地Z2彡70%。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明“TNF-a的細胞凋亡型激動劑多肽”和“TNF_ a的細胞壞死型激動劑多肽”的片段、衍生物和類似物也包括在本發(fā)明范圍內。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的“TNF- a的細胞凋亡型激動劑多肽”和“TNF- a的細胞壞死型激動劑多肽”相同的生物學功能或活性(誘導凋亡或壞死)的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性 氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)該多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發(fā)明中，還包括具有與上述“TNF-a的細胞凋亡型激動劑多肽”和“TNF_ a的細胞壞死型激動劑多肽”相同功能的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-3個，較佳地1-2個，更佳地I個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為5個以內，較佳地為3個以內，更佳地為2個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。本發(fā)明多肽的變異形式包括同源序列和保守性變異體等。本發(fā)明還提供多肽的類似物。這些類似物與“TNF- a的細胞凋亡型激動劑多肽”和“TNF- a的細胞壞死型激動劑多妝”的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“保守性變異多肽”指與相應的“TNF- a的細胞凋亡型激動劑多肽”和“TNF-a的細胞壞死型激動劑多肽”的氨基酸序列相比，有至多5個，較佳地至多3個，更佳地至多2個，最佳地至多I個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表A進行氨基酸替換而產生。表A
最初的殘基I代表性的取代優(yōu)選的取代
Ala(A)Val；Leu ；IleVal
Arg(R)Lys ；Gln ；AsnLys
Asn(N)Gln ；His ；Lys ；ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys (C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu(E)AspAsp
Gly(G)Pro ；AlaAla
His (H)Asn ；Gln ；Lys ；ArgArg
He (I)Leu ；Val ；Met ；Ala ；PheLeu
Leu (L)lie ；Val ；Met ；Ala ；Phelie
Lys(K)Arg ；Gln ；AsnArg
Met (M)Leu ；Phe ；IleLeu
Phe(F)Leu ；Val ；Ile ；Ala ；TyrLeu
Pro (P)AlaAla
Ser(S)ThrThr
Thr(T)SerSer
Trp (W)Tyr ；PheTyr
Tyr (Y)Trp ；Phe ；Thr ；SerPhe
權利要求
1.一種鑒別引起細胞凋亡和/或細胞壞死的腫瘤壞死因子TNF-α激動劑多肽的方法，其特征在于，包括步驟 (a)提供基于腫瘤壞死因子TNF-α的多肽，所述多肽的長度為7_50個氨基酸； (b)測定所述多肽引起細胞凋亡的能力和測試所述多肽引起細胞壞死的能力，如果所述多肽能夠明顯引起細胞凋亡且引起凋亡的程度遠大于引起壞死的程度，則該多肽是引起細胞凋亡的TNF-α激動劑多肽；如果所述多肽能夠明顯引起細胞壞死且引起壞死的程度遠大于引起凋亡的程度，則該多肽是引起細胞壞死的TNF-α激動劑多肽。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，當該多肽滿足以下條件時，則該多肽是TNF- α的細胞凋亡型激動劑多肽 (i)該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%，更佳地彡50%，最佳地彡70% )細胞表達caspase-3或發(fā)生凋亡； ( )設Zl = Q1-Q2，則Zl彡20 %，其中Ql為在相同條件下，該多肽引起的胞內caspase-3表達(發(fā)生凋亡)的細胞百分比數(shù)量，而Q2為無多肽(或陰性多肽)引起胞內表達caspase-3的細胞百分比數(shù)量。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，當該多肽滿足以下條件時，則該多肽是TNF- α的細胞壞死型激動劑多肽 (i)在無caspase-3胞內表達的條件下,該多肽可引起彡20%(較佳地彡30%,更佳地彡50%，最佳地彡70% )細胞膜破壞(細胞壞死)； (ii)當無細胞凋亡或Zl5% (如0% )，設Z2 = Q3-Q4，則Z2彡20%，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細胞百分比數(shù)量，而Q4為無多肽(或陰性多肽)弓丨起的細胞細胞膜破壞的細胞百分比數(shù)量。
4.一種TNF-α的激動劑多肽，其特征在于，所述的多肽具有以下特征 (i)該多肽的序列來源于腫瘤壞死因子TNF-α的氨基酸序列； ( )該多肽的長度為7-50個氨基酸； (iii)該多肽具有明顯引起細胞凋亡或明顯引起細胞壞死的能力。
5.如權利要求4所述的激動劑多肽，其特征在于，所述的多肽是細胞凋亡型激動劑多肽； 更佳地，所述的細胞凋亡型激動劑多肽含有或具有選自下組的序列SEQID NO. :3、6、7、8、15和16 ;或者所述的細胞凋亡型激動劑多肽包括P8、P11、P12、P13、P20、P21、P13-2、P13-3、P13-4、P13-5、P13—6、P13—7、P13—8、P13—9、P13—10、P16—6、P16—7、P16—8、P16—9、P16-10、P16-11 或其組合。
6.如權利要求4所述的激動劑多肽，其特征在于，所述的多肽是細胞壞死型激動劑多肽； 更佳地，所述的細胞壞死型激動劑多肽含有或具有選自下組的序列SEQID NO. :9、10、和11 ;或者所述的細胞壞死型激動劑多肽包括P 14、P15、P16、P13-10、P14-1、P14-2、P14-3、P14-4、P16-5 或其組合。
7.—種藥物組合物，其特征在于，包括藥學上可接受的載體和如權利要求4所述的TNF-α的激動劑多肽。
8.如權利要求4所述的TNF-α的激動劑多肽的用途，其特征在于，用于制備誘導細胞凋亡和/或壞死的藥物組合物。
9.如權利要求4所述的TNF-α的激動劑多肽的用途，其特征在于，用于制備治療腫瘤的藥物組合物；或用于制備治療自身免疫病及感染性疾病的藥物組合物。
10.一種體外(非治療性)誘導細胞凋亡和/或細胞壞死的方法，其特征在于，在權利要求4所述的TNF- α的激動劑多肽存在下，培養(yǎng)細胞，從而誘導細胞凋亡和/或細胞壞死。
全文摘要
本發(fā)明涉及與凋亡或壞死相關的TNF-α短肽及其應用。具體地，本發(fā)明提供了鑒定引起細胞凋亡和壞死的腫瘤壞死因子TNF-α激動劑多肽的方法，以及用該方法鑒別出的多肽。本發(fā)明多肽具有明確的引起細胞凋亡和/或壞死的功能，因此可用于治療腫瘤、感染性疾病。
文檔編號A61K38/10GK102776264SQ20111011785
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月7日 優(yōu)先權日2011年5月7日
發(fā)明者姜石松 申請人:姜石松