專(zhuān)利名稱：香蜂草苷在制備治療或預(yù)防出血性疾病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及香蜂草苷在制備治療或預(yù)防出血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血具有營(yíng)養(yǎng)和滋潤(rùn)的作用。血在脈中循行，內(nèi)注五臟六腑，外濡皮肉筋骨，如環(huán)無(wú)端，運(yùn)行不息，以維持生理活動(dòng)所需的營(yíng)養(yǎng)。故《素問(wèn)，五臟生成篇》說(shuō)“肝受血而能視，足受血而能步，掌受血而能握，指受血而能攝?！贝送?，血又是氣的載體，又是機(jī)體精神意識(shí)思維活動(dòng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，故有“血?dú)庹?，人之神”之說(shuō)。出血過(guò)多可出現(xiàn)貧血，嚴(yán)重時(shí)并發(fā)出血性休克，危及生命。隨著生活水平的提高，開(kāi)發(fā)有效安全的止血藥物成為研發(fā)熱點(diǎn)。斷血流是唇形科植物蔭風(fēng)輪或風(fēng)輪菜的干燥地上部分，在民間廣為用做止血藥物其藥理作用得到廣泛證實(shí)韓傳環(huán)，周曉琳，葉壽山.斷血流口服液的藥效學(xué)研究.中藥藥理與臨床.1998，14(3)27-28，香蜂草苷是從斷血流中提取的一個(gè)成分，化學(xué)名為5，7-二羥基-4′-甲氧基雙氫黃酮-7-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。通過(guò)試驗(yàn)，我們驚奇的發(fā)現(xiàn)香蜂草苷在預(yù)防或治療內(nèi)出血、外出血等方面具有顯著作用。
香蜂草苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了香蜂草苷在制備治療或預(yù)防出血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了香蜂草苷在制備治療或預(yù)防內(nèi)出血的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了香蜂草苷在制備治療或預(yù)防陰道出血的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了香蜂草苷在制備治療或預(yù)防消化道出血的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了香蜂草苷在制備治療或預(yù)防病理性出血(血友病)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的香蜂草苷在用于上述任一用途時(shí)，其使用劑量范圍為5mg～500mg/天。
本發(fā)明提供了以香蜂草苷為活性成分用于治療或預(yù)防出血性疾病的藥物組合物。
本發(fā)明提供的藥物組合物，其活性成分的含量范圍為5-500mg。
本發(fā)明提供的藥物組合物可以通過(guò)口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或皮下、皮膚粘膜、陰道、靜脈途徑給藥。藥物組合物可以以粉針劑、注射液、栓劑、片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸或口服液的形式存在。本發(fā)明所提供的各種藥物劑型均可以以藥學(xué)常規(guī)方法制備而成。
以下詳細(xì)的描述將有助于更進(jìn)一步理解本發(fā)明。
外出血——體表可見(jiàn)到。血管破裂后，血液經(jīng)皮膚損傷處流出體外。
內(nèi)出血——體表見(jiàn)不到。血液由破裂的血管流入組織、臟器或體腔內(nèi)。陰道出血包括子宮功能性、功能失調(diào)性、子宮肌瘤、子宮肌腺癥、宮頸炎癥、宮頸癌、子宮內(nèi)膜炎、子宮肌炎、子宮內(nèi)膜癌、宮頸、宮體惡性腫瘤晚期引起的出血。
消化道出血包括上消化道出血和下消化道出血，前者是指食管、胃、十二指腸、胰腺、膽道等部位的出血；后者是指空腸、回腸和大腸出血被稱為下消化道出血。
創(chuàng)傷性出血是指因事故、手術(shù)引起的出血。
本發(fā)明人通過(guò)下列試驗(yàn)證實(shí)了香蜂草苷具有治療或預(yù)防的作用，下面的實(shí)施例用來(lái)更詳細(xì)的說(shuō)明本發(fā)明，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。
具體實(shí)施例方式制備實(shí)施例1制備香蜂草苷斷血流藥材粉碎后加入10倍量水，浸泡30分鐘后用水煮，煎煮2小時(shí)后，過(guò)濾，濾渣再加入10倍量水煎煮，過(guò)濾，合并濾液，濾液濃縮至五分之一體積時(shí)，加入1倍量的95％乙醇，攪勻，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，濾液用5倍體積水稀釋?zhuān)肁B-8大孔樹(shù)脂吸附，吸附樹(shù)脂用去離子水洗后，80％乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮后至無(wú)醇味后，用聚酰胺吸附，用40％的乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，用制備液相分離，蒸干即得，經(jīng)HPLC檢測(cè)，峰面積歸一化法其純度為98.6％。
薄層層析將分離制得的香蜂草苷用甲醇溶解后點(diǎn)樣10μl于硅膠G預(yù)制板(100×100mm)上，展開(kāi)劑為氯仿-甲醇-冰醋酸-水(70∶30∶10∶3)，顯色劑為10％的硫酸乙醇溶液，噴霧后加熱顯色。檢測(cè)結(jié)果表明香蜂草苷中無(wú)其它雜質(zhì)斑點(diǎn)。
液相色譜分析將分離制得的香蜂草苷用甲醇溶解后進(jìn)樣10μl，進(jìn)行HPLC分析，色譜條件如下色譜柱為L(zhǎng)UNA C18粒徑5μm，250mm×4.6mm，SUPELCO公司產(chǎn)品；流動(dòng)相為甲醇-0.2％的磷酸(v/v)為5050；流速為0.8ml/mim；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm；峰面積歸一化其純度為98％以上。本品為淡黃色粉末，mp209～211℃，TLC酸水解，產(chǎn)生Glc和Rham。UV(λmax，nm)281，326.ESI-MS595(M+H)+，1H-NMR(DMSO)12.02(1H，s，C5-OH)，7.46，6.97(各2H，d，J＝8.7Hz，2’，6’-H，3’，5’-H)，6.13(2H，s，6，8-H)，5.57(1H，dd，J＝12.6，2.8Hz，2-H)，4.96(1H，d，J＝7.5Hz，Glc1-H)，4.51(1H，brs，Rham 1-H)，3.77(3H，s，OCH3)，2.77(1H，dd，J＝17，2.7，3-H)1.08(3H，d，J＝6.0Hz，Rham-CH3)。1H-NMR譜、13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道陳靖宇，陳建民等，蔭風(fēng)輪的化學(xué)成分研究(I)*，天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1997，9(3)香蜂草苷的波譜數(shù)據(jù)基本一致。
制備例2制備片劑取香蜂草苷細(xì)粉適量，以淀粉為添充劑，以5％的淀粉漿作為粘合劑，制粒，加入硬脂酸鎂，混勻，用壓片機(jī)壓制為片劑?；虬幢绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)方法制備口崩片。
制備例3制備膠囊劑取香蜂草苷細(xì)粉適量，以淀粉為添充劑，加入硬脂酸鎂，混勻，直接填充為膠囊劑。
制備例4制備口服液取香蜂草苷細(xì)粉適量用蒸餾水溶解，再加入總體積10％的糖漿作為調(diào)味劑和3％苯甲酸鈉作為防腐劑分裝即得。
制備例5制備外用氣霧劑取香蜂草苷細(xì)粉適量用蒸餾水溶解，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，再加入總體積10％的異丙醇和3％苯甲酸鈉作為防腐劑，分裝并加入異丁烷、二氧化碳等適宜的拋射劑封裝即得。
制備例6制備注射液用生理鹽水將香蜂草苷溶解，以1mol/L鹽酸和1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為5.5±1.0，加入0.1％的針用活性炭80保溫30分鐘，G3垂熔玻璃漏斗過(guò)濾，0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾；濾液分裝于5ml的安瓿瓶中，熔封，滅菌即得。
制備例7制備凍干粉針用生理鹽水將香蜂草苷溶解，加入10％甘露醇，以1mol/L鹽酸和1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為5.5±1.0，加入0.1％的針用活性炭80保溫30分鐘，G3垂熔玻璃漏斗過(guò)濾，0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾；濾液分裝于7ml的西林瓶中，凍干，壓塞，壓鋁蓋即得。
試驗(yàn)例1.小鼠的斷尾出血實(shí)驗(yàn)1.1材料動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由山東省綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(魯)20030020。
藥物香蜂草苷片按制備例2制備，批號(hào)050415；香蜂草苷注射液按制備例6制備，批號(hào)050416；斷血流片，安慶乘風(fēng)制藥有限公司，批號(hào)040804。
2.1方法與結(jié)果取健康小鼠60只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組(生理鹽水)，香蜂草苷注射液(iv給藥)1mg/kg組、10mg/kg組和100mg/kg組，香蜂草苷片100mg/kg，斷血流片1g/kg組。各組連續(xù)給藥3天，每天一次，末次給藥0.5小時(shí)后，用手術(shù)刀將小鼠尾尖50mm處橫斷，待血液自行溢出時(shí)計(jì)時(shí)，每隔30s用濾紙吸血滴1次，直至血液自然停止，計(jì)算出血時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1香蜂草苷灌胃給藥后小鼠斷尾出血時(shí)間(x±s，n＝10)

*與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01如表1所示，香蜂草苷4個(gè)劑量組均能明顯縮短小鼠出血時(shí)間。
試驗(yàn)例2香蜂草苷對(duì)小鼠肝素抗凝血的抑制作用2.1材料動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由山東省綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷片按制備例2制備，批號(hào)050415；香蜂草苷注射液按制備例6制備，批號(hào)050416；斷血流片，安慶乘風(fēng)制藥有限公司，批號(hào)040804。
2.2方法與結(jié)果取健康小鼠70只，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，空白對(duì)照組(生理鹽水)，模型組(生理鹽水)，香蜂草苷注射液1mg/kg組、10mg/kg組和100mg/kg組，香蜂草苷片100mg/kg；斷血流片1g/kg組。各組連續(xù)給藥3天，每天一次，末次給藥0.5小時(shí)后，除空白對(duì)照組外，其它各組每只小鼠尾靜脈注射肝素60U/kg，15min后由內(nèi)眥球后靜脈叢取血，按毛細(xì)玻管法測(cè)定凝血時(shí)間(min)，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2.香蜂草苷對(duì)小鼠肝素抗凝血的抑制作用

*與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001如表2所示，香蜂草苷能明顯對(duì)抗肝素引起小鼠凝血時(shí)間的延長(zhǎng)。凝血時(shí)間顯著縮短。
試驗(yàn)例3香蜂草苷對(duì)脾胃虛寒出血模型止血作用的影響3.1材料 動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由山東省綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷片按制備例2制備，批號(hào)050415；香蜂草苷注射液按制備例6制備，批號(hào)050416；消炎痛，邯鄲滏榮制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)020203；乙醇，山東煙臺(tái)市化工廠生產(chǎn)，批號(hào)021127。平面體視顯微鏡，北京泰克儀器有限公司生產(chǎn)。
3.2方法與結(jié)果將昆明種小鼠50只隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組，香蜂草苷注射液高(10mg/kg)、低劑量(1mg/kg)組，香蜂草苷片100mg/kg組。空白組對(duì)照組飼以普通飲食，模型組及給藥組參照文獻(xiàn)[陳小野.實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué).北京北京醫(yī)科大學(xué)，中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1993.285]造摸，飼養(yǎng)10日后，禁食16h，外，其它各組利用消炎痛加乙醇，每日灌胃造模藥0.25ml/10g體重，連續(xù)給藥10d后，胃出血造模參照文獻(xiàn)[沈雅琴，陳光娟，朱自平.中藥蓽澄茄“溫中止痛”藥理研究.中藥藥理與臨床，1991(2)18]用消炎痛加乙醇法，腹腔注射消炎痛7.5mg/ml，0.1ml/10g體重，0.5h后，給藥組灌胃給予香蜂草苷，3h后重復(fù)灌胃1次，第2次灌胃2.5h后，模型組再灌胃50％乙醇，0.1ml/10g體重，解剖取胃，福爾馬林固定，解剖鏡下觀察腺胃部糜爛出血點(diǎn)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表3。
表2.香蜂草苷對(duì)脾胃虛寒出血模型止血作用

*與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001如表3所示，與模型對(duì)照組比較，香蜂草苷顯著降低胃潰瘍出血點(diǎn)數(shù)。
試驗(yàn)例4香蜂草苷對(duì)早孕大鼠子宮出血的影響4.1材料動(dòng)物SD大鼠，♀鼠220～250g，♂鼠250～300g，由山東省綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷片按制備例6制備，批號(hào)050415；香蜂草苷注射液按制備例6制備，批號(hào)050416；宮血寧膠囊云南白藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)030414；米非司酮上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)44040807，用時(shí)以5g/L羧甲基纖維素鈉配制成混懸液；米索前列醇北京紫竹藥業(yè)有限公司制造，批號(hào)42040705，用時(shí)以5g/L羧甲基纖維素鈉配制成混懸液。
4.2方法與結(jié)果造模大鼠每日20:00時(shí)♀、♂按2∶1比例合籠，次日08:00時(shí)進(jìn)行陰道涂片檢查，以發(fā)現(xiàn)精子為妊娠第1天。于第7天08:00和18:00時(shí)分別灌服米非司酮(13.8mg/kg)和米索前列醇(135ug/kg)，引起不完全流產(chǎn)模型。同時(shí)陰道內(nèi)置入定量棉球一個(gè)(棉球重75～80mg，用塑料薄膜包裹半側(cè)，以防血液漏出和尿液返流)。次日分別于08:00和18:00將棉球取出，放入塑料袋中密閉冷藏保存，同時(shí)置換一個(gè)新棉球于陰道內(nèi)，觀察陰道出血情況，連續(xù)至第14天。實(shí)驗(yàn)分組和給藥方法取48只妊娠大鼠，未造模的8只大鼠為空白對(duì)照組，其余40只造模大鼠隨機(jī)分為5組模型對(duì)照組、宮血寧組(0.1g/kg)、香蜂草苷注射液高劑量組(10mg/kg)、香蜂草苷注射液低劑量組(1mg/kg)。各組于造模次日(第8天)開(kāi)始灌胃，連續(xù)7d。按照文獻(xiàn)[王曉東，趙軍寧，張白嘉等.藥物致早孕大鼠子宮出血模型的建立.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1999；15(2)182～184]的方法測(cè)定子宮出血量。結(jié)果見(jiàn)表4表4.香蜂草苷對(duì)早孕大鼠子宮出血的影響

*與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01如表4所示，與模型對(duì)照組比較，香蜂草苷顯著減少早孕大鼠子宮出血量。
試驗(yàn)例5香蜂草苷對(duì)離體家兔動(dòng)脈條的作用5.1材料動(dòng)物新西蘭大白兔，雌雄各半，1.5～2.5kg，由山東省綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷溶液按制備例4制備，批號(hào)050416；去甲腎上腺素上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0306012，；Krebs液山東省綠葉天然藥物研究開(kāi)發(fā)有限公司藥理室配置；BIOPAC M150多導(dǎo)生理紀(jì)錄儀、張力傳感器(TSD105A)均為BIOPAC Systems，Inc.公司生產(chǎn)。
5.2方法與結(jié)果家兔胸主動(dòng)脈條的制備取健康家兔(1.5～2.5kg)，雌雄兼用。猛擊家兔頭部，剪取胸主動(dòng)脈制成3×30mm的螺旋形肌條，將肌條置于含有改良Krebs液中(38±0.5)℃，pH值為7.2～7.4，通以95％O2+5％CO2。肌條一端固定在通氣鉤上，另一端通過(guò)肌張力傳感器記錄在BIOPAC M150多導(dǎo)生理紀(jì)錄儀上，負(fù)荷2g張力，平衡1.5～2h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，用0.01％去甲腎上腺素檢驗(yàn)血管收縮活性。穩(wěn)定后加入香蜂草苷溶液(濃度A組、濃度B組、濃度C組)，記錄收縮曲線，作用達(dá)高峰后，繼續(xù)記錄一段時(shí)間，觀察作用維持時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)表5
表5.香蜂草苷溶液對(duì)兔主動(dòng)脈條的作用

表5可見(jiàn)，香蜂草苷可提高血管收縮力，具有較強(qiáng)的縮血管作用。
試驗(yàn)例6香蜂草苷對(duì)正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的作用6.1材料動(dòng)物SD大鼠，♂鼠250～300g，由山東省綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(魯)20030020。
香蜂草苷溶液按制備例4制備，批號(hào)050416；；Krebs液山東省綠葉天然藥物研究開(kāi)發(fā)有限公司藥理室配置；BIOPAC M150多導(dǎo)生理紀(jì)錄儀、張力傳感器(TSD105A)均為BIOPACSystems，Inc.公司生產(chǎn)。
6.2方法與結(jié)果取雌性未孕SD大鼠(體重250～300g)50只，隨機(jī)分5組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前24～48h皮下注射已烯雌酚1mg/kg體重促發(fā)情。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠處死，取子宮約長(zhǎng)2cm，一端固定在通氣鉤上，另一端通過(guò)肌張力傳感器記錄在BIOPAC M150多導(dǎo)生理紀(jì)錄儀上，負(fù)荷2g張力，平衡1.5～2h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，用0.01％去甲腎上腺素檢驗(yàn)子宮的收縮活性。穩(wěn)定后加入香蜂草苷溶液(高濃度組A、中濃度組B、低濃度組C)、縮宮素溶液D，記錄收縮曲線，收縮幅度、收縮頻率，結(jié)果見(jiàn)表6。
表6.香蜂草苷溶液對(duì)正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的作用

*與用藥前比較，*P＜0.05表6可見(jiàn)，香蜂草苷和縮宮素對(duì)正常大鼠子宮平滑肌收縮幅度、收縮頻率均有明顯影響，其效果與縮宮素接近，經(jīng)檢驗(yàn)與用藥前有顯著性差異(P＜0.05)。
權(quán)利要求
1.以香蜂草苷為活性成分的用于治療或預(yù)防出血性疾病的藥物組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其活性成分的含量范圍為5-500mg。
3.香蜂草苷在制備治療或預(yù)防出血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，香蜂草苷在制備治療或預(yù)防內(nèi)出血的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，香蜂草苷在制備治療或預(yù)防陰道出血的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，香蜂草苷在制備治療或預(yù)防消化道出血的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，香蜂草苷在制備治療或預(yù)防病理性出血(血友病)的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，香蜂草苷在制備治療或預(yù)防外出血的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，香蜂草苷在制備治療或預(yù)防創(chuàng)傷性出血的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了香蜂草苷在制備治療或預(yù)防出血性疾病的藥物中的應(yīng)用，具體地提供了香蜂草苷在制備治療或預(yù)防內(nèi)出血、陰道出血、消化道出血、病理性出血及外出血的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P7/04GK1872083SQ20051004369
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2005年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月31日
發(fā)明者宋吉倫, 張紅香, 王超云 申請(qǐng)人:山東綠葉天然藥物研究開(kāi)發(fā)有限公司