專利名稱：環(huán)脂肽類抗生素及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的環(huán)脂肽類抗生素一環(huán)九肽菌素及其制備與應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于抗生素的廣泛應(yīng)用或?yàn)E用，使得一度在細(xì)菌感染性疾病治療中起著顯著作用的抗生素出現(xiàn)了廣泛的失效。許多常見細(xì)菌對(duì)常用抗生素的耐藥性不斷增強(qiáng)。目前，細(xì)菌耐藥性已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類的健康。耐甲氧西林金黃葡萄球菌，耐青霉素肺炎鏈球菌以及產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的大腸埃希菌和克雷伯菌等多重耐藥菌已成為醫(yī)院中傳播率和致死率很高的病原體。耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)的快速出現(xiàn)，加劇了人們對(duì)致病菌耐藥性問(wèn)題的擔(dān)心。另外，隨著免疫抑制劑和廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)管、插管、燒傷搶救、放化療和 器官移植的推廣，真菌感染的發(fā)病率也逐年增加。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，近10年來(lái)，全身性真菌感染的發(fā)病率增加了 3 5倍，而且預(yù)后差、死亡率高。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，可將上市的抗真菌藥分為四大類丙烯類(特比萘芬)、多烯類(兩性霉素B等)、唑類(伊曲康唑等)、棘白霉素類(卡泊芬凈)等。特比萘芬療效低，不能單獨(dú)給藥；多烯類有嚴(yán)重的不良反應(yīng)；唑類僅能抑制而不能殺滅真菌；棘白霉素類雖然對(duì)于念珠菌屬以及曲霉菌屬均有效，而且安全性較高，但卻面臨尚無(wú)口服劑型和價(jià)格昂貴等兩大問(wèn)題，故而限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用。鑒于此，尋找結(jié)構(gòu)新穎、不易產(chǎn)生交叉耐藥以及適合工業(yè)化生產(chǎn)的新型抗生素將是人類面臨的一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述不足之處，提供一種針對(duì)臨床耐藥致病菌，具有潛在醫(yī)療應(yīng)用價(jià)值的新的脂肽類抗生素——環(huán)九肽菌素的制備方法與應(yīng)用。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種環(huán)脂肽類抗生素，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式如下
權(quán)利要求
1.一種環(huán)脂肽類抗生素，其特征是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式如下
2.一株制備環(huán)脂肽類抗生素的菌株，其特征是所述菌株為類芽孢桿菌(Paenibacillus ehirnensis strain B7),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2012年6月24日，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012244。
3.環(huán)脂肽類抗生素的制備方法，其特征是步驟為 (1)培養(yǎng)發(fā)酵將類芽抱桿菌(Paenibacillusehirnensis strain B7)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，得到活化菌株，活化菌株在種子培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)兩次，得到二級(jí)種子液，二級(jí)種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)發(fā)酵，得到發(fā)酵液，離心、取發(fā)酵液上清，去沉淀，先經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，將發(fā)酵上清以合適速度流經(jīng)用蒸餾水平衡好的、裝填有大孔吸附樹脂的層析柱； (2)分離純化待樣品上完后,先分別用蒸餾水和甲醇水溶液沖洗,然后用甲醇水溶液洗脫；收集各洗脫峰，測(cè)活，將活性組分濃縮蒸干得到粗品；將粗品用甲醇溶解，離心過(guò)濾，用固相萃取柱進(jìn)一步純化；再用制備型高效液相色譜進(jìn)行精純，收集活性組分，濃縮、凍干即可得到所述環(huán)九肽菌素。
4.如權(quán)利要求3所述環(huán)脂肽類抗生素的制備方法，其特征是具體步驟為 (1)將保存于-80V冰箱的甘油管中的類芽孢桿菌(Paenibacillus ehirnensisstrain B7)轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 35°C培養(yǎng)24 96h，得到活化菌株； 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按如下組成配制牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水IOOOmL, pH7. 2 ； (2)將活化菌株接入盛于250mL三角瓶的50mL種子培養(yǎng)基中，于28 35°C，220rpm振蕩培養(yǎng)24h，即為一級(jí)種子液； (3)將步驟(2)所得的一級(jí)種子液接入盛于500mL三角瓶的200mL種子培養(yǎng)基中，于·28 35°C，220rpm振蕩培養(yǎng)24h，即為二級(jí)種子液； 種子培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，按如下組成配制牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，自來(lái)水 IOOOmL, ρΗ7· 2 ； (4)將步驟(3)所得的二級(jí)種子液按體積比5% 10%的接種量接入含500mL發(fā)酵培養(yǎng)基的2L三角瓶中，于28 35°C，200rpm振蕩培養(yǎng)96h，獲得發(fā)酵液； 發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制:葡萄糖，O 10g/L ；CaCl2,0. 01 O. 7g/L ；MgS04 · 7H20，·0. 05 lg/L ；ZnS04,0 . 00 5 0. lg/L ；NaCl,0. 05 0. 5g/L ;FeS04,0 . 00 5 0. 05g/L ；(NH4)2SO47O. 5 4. Og/L ；MnS04 · H20,0. 001 0. Olg/L ；KH2PO4, 0. 5 5g/L ;溶劑為蒸餾水，pH 7· 0 7· 5 ; (5)步驟(4)取得的發(fā)酵液轉(zhuǎn)到離心瓶中，平衡后于6500X g離心30min，去除沉淀，得澄清發(fā)酵上清液； (6)將步驟(5)所得的上清液以10 50mL/min的流速流穿用蒸餾水平衡好的Amberlite XAD-16層析柱，待樣品上完后分別用蒸餾水及含體積比為45%的甲醇的水溶液各沖洗5個(gè)床體積，然后用含體積比為90%的甲醇的水溶液洗脫，收集體積比為90%的甲醇水溶液洗脫的洗脫峰，55 65°C濃縮蒸干，得到粗品I ; (7)將粗品I用甲醇溶解，用O.45 μ m的濾膜過(guò)濾后上樣至用體積比25%的乙腈水溶液平衡好的C-18固相萃取柱，樣品加完后再用體積比為25%的乙腈水溶液沖洗5個(gè)床體積，然后用體積比65%的乙腈水溶液洗脫，收集洗脫峰，濃縮蒸干，得到粗品2 ； (8)將粗品2用甲醇溶解、12000rpm離心lOmin，并過(guò)O.45μΜ濾膜后，用制備型HPLC進(jìn)行分離；分離后A液為含體積比O. 1%三氟乙酸的水溶液，B液為色譜純乙腈；洗脫梯度為在40min時(shí)間里B液從體積比15%提高到60% ;收集活性部分，55 65 °C濃縮、-50°C _60°C真空冷凍干燥，即得產(chǎn)品環(huán)脂肽類抗生素。
5.如權(quán)利要求4所述環(huán)脂肽類抗生素的制備方法，其特征是所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖，3. 5g/L ；CaCl2,0. 05g/L ；MgS04 · 7Η20，0· lg/L ；ZnS04,0. Olg/L ；NaCl,0. 3g/L ；FeS04,0. Olg/L ； (NH4)2SO4, 2. 5g/L ；MnSO4 · H20,0. 004g/L ；KH2PO4, 2. 5g/L ;溶劑為水，pH 7. 0 7. 2。
6.環(huán)脂肽類抗生素的應(yīng)用，其特征是環(huán)脂肽類抗生素能夠用于制備抗細(xì)菌感染藥物。
7.如權(quán)利要求6所述環(huán)脂肽類抗生素的應(yīng)用，其特征是環(huán)脂肽類抗生素用于制備抗多重耐藥細(xì)菌所致感染的藥物。
8.如權(quán)利要求7所述環(huán)脂肽類抗生素的應(yīng)用，其特征是環(huán)脂肽類抗生素用于制備抗多重耐藥革蘭氏陰性菌所致感染的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的環(huán)脂肽類抗生素—環(huán)九肽菌素及其制備與應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。其將類芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，于28~35℃下培養(yǎng)24~96h，離心、取發(fā)酵液上清，先經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，然后經(jīng)進(jìn)一步分離純化得到所述環(huán)脂肽類抗生素，可應(yīng)用于制備抗細(xì)菌感染藥物。本發(fā)明提供了一種毒性優(yōu)于多粘菌素B、具有較高醫(yī)療應(yīng)用價(jià)值的環(huán)九肽菌素及其制備方法和應(yīng)用，體外實(shí)驗(yàn)表明該化合物對(duì)所有測(cè)試過(guò)的革蘭氏陽(yáng)性和陰性致病菌，包括多重耐藥以及超級(jí)耐藥菌，均具有顯著的抑制作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明該化合物對(duì)超廣譜耐藥銅綠假單胞引起的小鼠敗血癥具有明顯的防治效果。
文檔編號(hào)A61K38/08GK102911257SQ20121035678
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者黃朝暉 申請(qǐng)人:無(wú)錫市第四人民醫(yī)院