專利名稱：楊梅花青素提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物有效成分的提取工藝領(lǐng)域，具體說，是楊梅花青素提取物的提取和制備。本發(fā)明還涉及楊梅花青素提取物的組合物及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

背景技術(shù)：
花青素類已是國際公認(rèn)的安全無毒的天然食品著色劑，歐共體色素標(biāo)準(zhǔn)中對來源于果蔬的花青素的使用不作量的限制。但是由于各種果蔬中的各類成分相差徑庭，花青素類成分組成也不同，加之性質(zhì)不穩(wěn)定，因此，制備工藝相差很大。我國僅有蘿卜紅、葡萄皮紅、黑豆紅三種花青素類天然食品著色劑，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中主要評(píng)價(jià)指標(biāo)色價(jià)均小于20(按我國定義)，純度較低。歐共體花青素主要評(píng)價(jià)指標(biāo)色價(jià)為30(按我國定義)，純度較高。但無論國內(nèi)外，都未對主要色素成分進(jìn)行含量測定，僅使用吸光值來評(píng)價(jià)色價(jià)，這對花青素類天然食品著色劑的內(nèi)在質(zhì)量控制是一種欠缺。
本領(lǐng)域中已經(jīng)有很多對楊梅色素進(jìn)行的研究。馬銀海等(食品科學(xué)，2004，Vol.25，No.7，p.112-113)公開了一種提取楊梅紅色素的方法，主要是通過酸浸泡然后過大孔樹脂純化。該方法是一種實(shí)驗(yàn)室方法，其中的樹脂、淋洗液、洗脫所用的條件都跟本發(fā)明的方法不同。林璇等(漳州師范學(xué)院化學(xué)系，2002年8月，15卷，3期，pp.98-101)公開了一種實(shí)驗(yàn)室使用的矢車菊苷分離方法，以及對楊梅紅色素進(jìn)行了研究。然而，該方法是一種非常復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的方法，因此沒有工業(yè)上應(yīng)用的意義。該文獻(xiàn)還描述了楊梅紅色素中含有矢車菊苷，以及楊梅紅色素的理化性質(zhì)等。然而，該文獻(xiàn)中描述的色素隨著pH的增加而顏色呈紅→綠→藍(lán)變化，而在葉日英，農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā)，2000第1期中，認(rèn)為色素是呈紅色到綠色變化。此外，在高居易，天然產(chǎn)品研究與開發(fā)，Vol.13，No.2，pp.59-62中，認(rèn)為該紅色色素在水溶液中34％下就達(dá)到飽和。
如上所述，這些研究的結(jié)果差異很大，原因是由于提取方法粗，成分差異大。因此，需要一種標(biāo)準(zhǔn)的提取方法，來獲得有效的楊梅花青素，以及與其配套的工業(yè)生產(chǎn)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。
此外，食品藥品著色劑在工業(yè)應(yīng)用中有相當(dāng)大的重要性，并且也是常用的工業(yè)產(chǎn)品。近年來，對于這些著色劑發(fā)生了很多的爭端，有許多以前常用的食品著色劑被發(fā)現(xiàn)是對人體有害的，例如可能導(dǎo)致癌癥等。因此，對于天然無害的食品著色劑有很大的市場需求。


發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備楊梅花青素提取物的方法，該方法包括步驟 (a)用1-10倍鮮果重量的50-95％重量的乙醇水溶液浸泡楊梅果肉4小時(shí)以上，優(yōu)選12小時(shí)； (b)過濾，除去乙醇，得到藥液； (c)將所得藥液調(diào)至pH至1-4，優(yōu)選pH1-2，過大孔樹脂吸附柱； (d)用水洗滌柱，至流出液為無色； (e)用20％-95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液； (f)過濾，回收乙醇，40-80℃真空干燥得到的洗脫液。
在該方面的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(a)中的乙醇水溶液是藥材重量的5倍。
在該方面的另一個(gè)實(shí)施例中，步驟(a)中的乙醇水溶液濃度是90％重量。
在該方面的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(e)中的乙醇優(yōu)選是30-85％重量，更優(yōu)選是50％重量的水溶液。
在該方面的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(e)中還包括用高效液相層析法在515nm波長下，流速1.0ml/分鐘，25℃下，用乙腈∶甲酸∶水＝10∶10∶100檢測楊梅花青素成分矢車菊素-3-葡萄糖的含量。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了上述方法獲得的楊梅花青素提取物。其中楊梅花青素提取物色價(jià)(按中國定義)在40以上，矢車菊素-3-葡萄糖在總提取物中的含量為5-30％重量。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了上述楊梅花青素提取物的用途，其特征在于，用作食品或藥物的著色劑。

具體實(shí)施例方式 楊梅(Mynica rubra Sied.et Zucc)是一種常見的水果。本發(fā)明中所用的楊梅為集市購得。
本發(fā)明的楊梅花青素提取方法采用乙醇作為提取試劑，然后使用大孔樹脂純化，與常規(guī)的乙醇粗浸取或酸水提取然后大孔樹脂純化的條件不同，洗脫條件也不相同，因此理化參數(shù)等有很大的差異。
本發(fā)明中步驟(b)中的回收乙醇步驟，使得獲得的藥液濃縮，從而能吸附在大孔樹脂上有效分離所需的組分。回收是通過常規(guī)方法進(jìn)行的，例如減壓蒸餾等。
本發(fā)明的柱層析使用各種常規(guī)的大孔樹脂吸附柱，可采用各種醫(yī)藥級(jí)大孔吸附樹脂，常用的樹脂是極性苯乙烯骨架。優(yōu)選樹脂購自西安藍(lán)曉科技有限公司的LSA-33、LSA-20和XDA-1。在使用前可先用水平衡。上樣，洗滌，洗脫速度不受限制，但優(yōu)選在30-300ml/分鐘之間，最優(yōu)選是60ml/min。
本發(fā)明的洗滌液可使用極性溶劑，例如去離子水等對柱進(jìn)行洗滌。
該方面的另一個(gè)實(shí)施例中包括了檢測步驟，該檢測步驟是在步驟(e)洗脫過程中使用常規(guī)的HPLC(高效液相層析)，例如硅膠柱等，對洗脫液中的矢車菊素-3-葡萄糖成分進(jìn)行檢測，檢測波長為515nm，流速為1.0ml/分鐘，25℃下，乙腈∶甲酸∶水＝10∶10∶100。如在該洗脫液中沒有矢車菊素-3-葡萄糖峰出現(xiàn)則證明其洗脫完全。
本發(fā)明(f)中所使用的過濾裝置可以是各種常規(guī)過濾裝置。例如濾紙真空吸濾，多孔樹脂，分子篩，填充柱等。
本發(fā)明提取物色價(jià)(中國定義)在40以上，是常規(guī)乙醇浸出法的5倍以上，提取效率達(dá)到60％以上，有效成分得率為0.2％以上，同時(shí)，由于操作步驟簡單，沒有TLC，電泳等昂貴步驟，可用于大批量工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明獲得的楊梅花青素提取物的主要成分是矢車菊素-3-葡萄糖，作為著色劑，它完全沒有毒性和副作用，因此，非常適合工業(yè)和商業(yè)用作食品和藥品的著色劑。
實(shí)施例 實(shí)施例1楊梅花青素的提取 1.材料和儀器 材料蘇州集市市售的楊梅50kg。
樹脂LSA-33、LSA-20和XDA-1，購自西安藍(lán)曉科技有限公司 儀器多功能提取罐(500L)，常州武進(jìn)孟河制藥機(jī)械廠 2.提取方法 三批楊梅(集市購得)分別去核取肉，分別用2、5、9倍鮮果量的90、85、65％乙醇浸泡提取12、8、4小時(shí)，過濾得乙醇提取液，回收乙醇，殘液加水稀釋，過濾，濾液以鹽酸分別調(diào)pH酸性至1、3、5，分別過大孔樹脂LSA-33、LSA-20和XDA-1吸附柱，樹脂用量為藥材量的1/3、1、2，藥液過完柱床后用水洗柱床(流速300ml/min、不限)至流出液為無色，再分別用30％、50％、85％乙醇洗脫至流出液為無色(流速200ml/min、100ml/min、50ml/min)，至用高效液相層析柱(反相硅膠柱，中科院大連化學(xué)物理研究所)在515nm波長下，流速1.0ml/分鐘，25℃下，用乙腈∶甲酸∶水＝10∶10∶100檢測矢車菊素-3-葡萄糖的含量，至不出現(xiàn)其峰； 收集乙醇洗脫液，過濾，回收乙醇，80℃水浴蒸干，40-80℃真空烘干，得楊梅花青素提取物。
三批約50公斤的楊梅鮮果經(jīng)提取，楊梅花青素的最終提取率在60％以上，得率在0.2％以上。用中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB9992-88的檢測矢車菊素-3-半乳糖苷(雖然該方法用于黑豆提取物，但是其同樣是用于檢測矢車菊素的方法，并且也是用于經(jīng)植物提取后的固體)，發(fā)現(xiàn)檢測楊梅花青素提取物的E值大于40(相當(dāng)于歐共體和國際糧農(nóng)組織色價(jià)定義400，歐共體花青素標(biāo)準(zhǔn)中花青素提取物色價(jià)為300)，結(jié)果見下表1。
表1三批楊梅花青素提取中試結(jié)果 注

其中A是吸光度，W是樣品質(zhì)量(g)，E表示色價(jià)，C-楊梅紅溶液濃度；L-比色杯溶液厚度，cm。
三批提取物的色價(jià)都大于40(我國標(biāo)準(zhǔn))?；ㄇ嗨靥崛∥锏寐识荚?0％以上。
實(shí)施例2產(chǎn)品的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)三批中試樣品制定了楊梅花青素提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如下 本標(biāo)準(zhǔn)適用于以楊梅(Mynica rubra Sied.et Zucc)成熟果實(shí)為原料，用乙醇溶液提取經(jīng)大孔樹脂純化的提取物，經(jīng)濃干燥制得的紫紅色粉末，在食品藥品工業(yè)中作為著色劑?；瘜W(xué)名稱矢車菊素-3-葡萄糖苷分子式C21H21O11分子量449.39(按1983年國際原子量) 1技術(shù)要求 1.1外觀本品為紫紅色粉末。
1.2理化要求 表2 2實(shí)驗(yàn)方法 2.1 pH將樣品配成1％水溶液用酸度計(jì)測定。
2.2吸光度精密稱定樣品約0.1g，加50％乙醇定容到100ml。從中取10ml，再以0.02M鹽酸溶液(PH3.0)定容至100ml。取出稀釋液潿于1cm比色杯中，用分光光度計(jì)在波長515±5nm處，以鹽酸溶液(PH3.0)為參比液，測定其吸光度(E)。
式中A-吸光度；C-楊梅紅溶液濃度；L-比色杯溶液厚度，cm。
注
A-吸光度，稱定樣品定容到100ml溶液測定，比色杯厚度1cm；W-稱樣量，g。
2.3矢車菊素-3-葡萄糖苷含量測定 用HPLC法進(jìn)行測定，流動(dòng)相為乙腈∶甲酸∶水10∶10∶100，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃，檢測波長為515nm。
2.4水分精確稱取樣品1g(準(zhǔn)確至0.002g)，置于恒重的稱量瓶中，于105±1℃烘箱灼約4h，冷卻、稱重，至恒重。
式中X-樣品中水分含量，％；G1-稱量瓶加樣品質(zhì)量，g；G2-干燥后稱量瓶加樣品質(zhì)量，g％；G-樣品質(zhì)量，g。
2.5灰分精確稱取樣品3g(準(zhǔn)確至0.01g)置于已恒重的坩堝中，先炭化(約300℃)，再移入800±25℃馬福爐中灼燒至恒重。
式中X2-樣品中灰分含量，％；G-灰分質(zhì)量，g；W-樣品質(zhì)量，g。本品在包裝完整，未經(jīng)啟封情況下，保質(zhì)期為一年。
2.6大孔樹脂殘留物的檢測方法精密稱取供試品0.5g，置頂空瓶中，精密加入5ml1％甲醇溶液溶解，作為供試品溶液。另精密稱取1，4-二乙烯基苯適量，分別加入甲醇溶液溶解并稀釋制成每1ml中含1mg的對照品儲(chǔ)備液。精密量取上述儲(chǔ)備液適量，加入二甲亞砜溶解并稀釋制成1ml中含2ug的混合溶液。精密量取混合液5ml置頂空瓶中作為對照品溶液，照氣相色譜頂空進(jìn)樣法測定，頂空恒溫箱溫度85℃，傳輸管溫度110℃，進(jìn)樣環(huán)溫度100℃，色譜柱HP-INNOWAX(30m×0.25mm×0.25mm)，檢測器FID，檢測器溫度240℃，進(jìn)樣口溫度150℃，柱溫60℃(5min)→94℃，升溫速度每分鐘8℃，再以8℃/10min升至190℃。含1，4-二乙烯基苯不得超過50ug/kg。
3.三批中試產(chǎn)品的質(zhì)量報(bào)告 實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了三批中試產(chǎn)品，同時(shí)也對比了三批楊梅鮮果汁干燥物的品質(zhì)，下文表3顯示了三批中試產(chǎn)品的質(zhì)檢結(jié)果和原料檢驗(yàn)結(jié)果，以及和乙醇粗提取物的對比。
表3三批中試產(chǎn)品質(zhì)檢結(jié)果及原料檢驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明楊梅紅提取物色價(jià)遠(yuǎn)高于楊梅鮮果汁干燥物(即表中原汁1、2、3)。工藝中除去了大量果糖和果酸及大分子成分，使楊梅紅提取物色價(jià)高、性質(zhì)穩(wěn)定、不易吸潮、易于存放。
實(shí)施例3楊梅花青素作為著色劑的用途 (1)在食品著色劑中的用途 該產(chǎn)品主要用于酸性的食品，實(shí)驗(yàn)考察了楊梅紅在飲料、冰淇淋、雪糕、棒冰、糖果、果凍、配制果酒、蛋糕上彩裝等食品中的使用情況，結(jié)果表明其在水和乙醇中溶解度很大，著色性能良好，儲(chǔ)藏期內(nèi)各食品的色素吸光值穩(wěn)定，并且除鐵離子和強(qiáng)氧化劑外可與各類食品常用添加劑混用。常用量為10-100mg每公斤食品。
I.飲料配方碳酸水、白砂糖、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、維生素C、香精，分別加入楊梅紅提取物0.01％、0.02％、0.05％，按飲料常規(guī)方法配制，滅菌灌裝后，置37℃避光處按藥品的加速穩(wěn)定性法進(jìn)行該飲料的穩(wěn)定性考察。每個(gè)月取樣進(jìn)行檢測，連續(xù)檢測三個(gè)月，結(jié)果顯示飲料的吸光值穩(wěn)定，即色澤無明顯變化，說明該飲料保質(zhì)期在一年以上。
檢測方法取樣品2ml加8ml0.02M鹽酸溶液稀釋，過濾，取出稀釋液潿于1cm比色杯中，用分光光度計(jì)在波長515±5nm處，以鹽酸溶液(PH3.0)為參比液，測定其吸光度(E)。結(jié)果見表4。
表4飲料的三個(gè)月加速穩(wěn)定性(n＝3) 由此可見，三個(gè)月后飲料中楊梅紅提取物并沒有明顯的損失，飲料外觀沒有明顯變化。
II.冰淇淋配方蛋黃、白砂糖、代可可脂、奶粉、水、香精，分別加入楊梅紅提取物0.05％、0.1％、0.2％，按冰淇淋常規(guī)方法配制，滅菌灌裝后，置37℃避光處按藥品的加速穩(wěn)定性法進(jìn)行該冰淇淋的穩(wěn)定性考察。每個(gè)月取樣進(jìn)行檢測，連續(xù)檢測三個(gè)月，結(jié)果顯示冰淇淋的吸光值穩(wěn)定，即色澤無明顯變化，說明該冰淇淋保質(zhì)期在三個(gè)月以上。
檢測方法取樣品2g加8ml0.02M鹽酸溶液稀釋，過濾，取出稀釋液潿于1cm比色杯中，用分光光度計(jì)在波長515±5nm處，以鹽酸溶液(PH3.0)為參比液，測定其吸光度(E)。結(jié)果見表5。
表5冰淇淋的三個(gè)月加速穩(wěn)定性(n＝3) III.糖果配方白砂糖、葡萄糖、煉乳、檸檬酸、植物油、香精，分別加入楊梅紅提取物0.01％、0.02％、0.05％，按糖果常規(guī)方法配制，滅菌灌裝后，置37℃避光處按藥品的加速穩(wěn)定性法進(jìn)行該糖果的穩(wěn)定性考察。每個(gè)月取樣進(jìn)行檢測，連續(xù)檢測三個(gè)月，結(jié)果顯示糖果的吸光值穩(wěn)定，即色澤無明顯變化，說明該糖果保質(zhì)期在一年以上。
檢測方法取樣品2g加8ml0.02M鹽酸溶液稀釋，過濾，取出稀釋液潿于1cm比色杯中，用分光光度計(jì)在波長515±5nm處，以鹽酸溶液(PH3.0)為參比液，測定其吸光度(E)。結(jié)果見表6。
表6糖果的三個(gè)月加速穩(wěn)定性(n＝3) 實(shí)施例4該產(chǎn)品的安全性 (1)急性毒性 為了提供試驗(yàn)安全使用的劑量范圍，對楊梅紅進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)。
在預(yù)備試驗(yàn)中，小鼠灌服大劑量楊梅紅提取物亦不致死，不能測出半數(shù)致死量，故采用最大給藥量試驗(yàn)。
受試藥物 楊梅花青素，由蘇州思源醫(yī)藥科技開發(fā)公司提供。
配制加蒸餾水，配制成每ml含100mg楊梅紅提取物的混懸液，供灌胃用。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠40只，18～21g，雌雄各半，由中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
試驗(yàn)方法與結(jié)果 取健康小鼠20只，雌雄各半，1ml/10g灌胃給藥，一日內(nèi)灌胃3次，連續(xù)觀察7日。
小鼠給藥當(dāng)日，行動(dòng)緩慢，進(jìn)食減少。次日恢復(fù)食量，活動(dòng)、大便均正常。觀察7日未見死亡，第8日空腹12h稱重，尸解未見主要臟器有異常。體重變化見表7。
表7A-2小鼠急性毒性試驗(yàn)體重變化(

) 與給藥前比，***P＜0.01 由表7可見，小鼠灌服楊梅紅提取物，體重正常增長。
在小鼠急性毒性試驗(yàn)中，采用最大給藥量法，楊梅紅提取物小鼠量大1000mg/kg，再次對人進(jìn)行試驗(yàn)。人最大用量為100mg/kg，成人以60kg計(jì)，每人每天最大用量為6000mg。給藥后觀察7日，均未出現(xiàn)死亡及明顯中毒反應(yīng)，體重正常增長。
以上結(jié)果說明該色素安全、無毒。
權(quán)利要求
1.一種制備楊梅花青素提取物的方法，其特征在于，該方法包括步驟
(a)用1-10倍鮮果重量的50-95％重量的乙醇水溶液浸泡楊梅果肉4小時(shí)以上；
(b)過濾，除去乙醇，得到藥液；
(c)將所得藥液調(diào)至pH至1-4，過大孔樹脂吸附柱；
(d)用水洗滌柱，至流出液為無色；
(e)用20％-95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；
(f)過濾，回收乙醇，40-80℃真空干燥得到的洗脫液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中的乙醇水溶液是藥材重量的5倍。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中的乙醇水溶液濃度是90％重量。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸泡時(shí)間為12小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH為1-2。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(e)中的乙醇是40-90％重量的水溶液。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(e)中的乙醇是60％重量的水溶液。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)中還包括用高效液相層析法在515nm波長下，流速1.0m1/分鐘，25℃下，用乙腈∶甲酸∶水＝10∶10∶100檢測楊梅花青素成分矢車菊素-3-葡萄糖的含量。
9.一種楊梅花青素提取物，其特征在于該提取物是用權(quán)利要求1所述的方法制備的，其中楊梅花青素提取物色價(jià)(按我國定義)大于40，其中矢車菊素-3-葡萄糖濃度為5-30％重量。
10.權(quán)利要求8所述的楊梅花青素提取物的用途，其特征在于，用作食品或藥物的著色劑。
全文摘要
公開了一種制備楊梅花青素提取物的方法，包括步驟(a)用1－10倍鮮果重量的50－95％重量的乙醇水溶液浸泡楊梅果肉4小時(shí)以上；(b)過濾，除去乙醇，得到藥液；(c)將所得藥液調(diào)至pH至1－4，過大孔樹脂吸附柱；(d)用水洗滌柱，至流出液為無色；(e)用20％－95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；(f)過濾，回收乙醇，40－80℃真空干燥得到的洗脫液。還公開了用該方法制備的楊梅花青素提取物，及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和用作食品或藥物的著色劑的用途。
文檔編號(hào)A61K36/185GK1986539SQ20051011168
公開日2007年6月27日 申請日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者徐麗華, 黃芳 申請人:蘇州市思源醫(yī)藥科技有限公司