專利名稱：人工骨骼材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于骨損傷修復(fù)的人工骨骼材料。
背景技術(shù)：
近年，整形外科等領(lǐng)域中普遍使用人工骨骼材料進(jìn)行對(duì)各種疾患產(chǎn)生的骨損傷進(jìn)行修復(fù)。作為人工骨骼材料，主要使用磷酸二氫鈣類陶瓷。磷酸二氫鈣類陶瓷材料具有優(yōu)異生物相容性、良好的骨傳導(dǎo)能力，并有作為骨形成基礎(chǔ)的作用。但骨損傷嚴(yán)重時(shí)，單獨(dú)使用磷酸二氫鈣類陶瓷材料很難進(jìn)行修復(fù)，所以，對(duì)于這樣的病例只能移植自身的骨骼，但受采骨量限制，很難對(duì)骨損傷進(jìn)行修復(fù)。
基于這樣的背景，骨損傷嚴(yán)重的病例，期待著具有更高骨形成能力的材料，即具有骨誘導(dǎo)活性的移植用材料。以此為背景，以上述磷酸二氫鈣類陶瓷材料為載體，培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，進(jìn)行了植入細(xì)胞型人工骨骼材料的研究。
吉川等將人培養(yǎng)骨髓細(xì)胞和多孔羥磷灰石混合，在骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，將其移植到裸鼠腹腔內(nèi)，2個(gè)月后摘除，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)，證明骨形成明顯。(日整會(huì)志，73(3)，S672)。
在多孔陶瓷中植入培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的人工骨骼存在如下課題。
首先，要使骨髓細(xì)胞侵入到多孔陶瓷的中心。使用的多孔陶瓷的型號(hào)變大時(shí)，骨髓細(xì)胞很難進(jìn)入到中心部分。另外，即使細(xì)胞侵入到多孔陶瓷的中心部分，血管也不能到達(dá)中心部分，氧分壓低，還有不能發(fā)揮作為成骨細(xì)胞的功能的問題。
其次，作為植入細(xì)胞的載體的多孔材料存在如下課題。具體如下。成為載體的材料需要滿足如下條件載體必需有高的生物相容性，并且不影響培養(yǎng)細(xì)胞的活性，還要有骨傳導(dǎo)能力，并且在移植后進(jìn)行骨形成的同時(shí)載體本身可被吸收。作為載體的骨膠原或聚乳酸乙醇酸等具有生物降解能力，雖然能滿足作為載體條件的分解吸收性，但是骨傳導(dǎo)能力差，所以不是優(yōu)選的材料。
另一方面，磷酸二氫鈣類陶瓷的骨傳導(dǎo)能力優(yōu)異，從這點(diǎn)出發(fā)優(yōu)選這類材料。但是最常見的作為人工骨骼的HAP的磷酸二氫鈣很難在生物體內(nèi)被吸收，因此，從吸收性的角度出發(fā)，則不是優(yōu)選的材料。而β-磷酸鈣(β-TCP)具有良好的吸收性，并且具有骨傳導(dǎo)能力，是作為載體的最理想材料。
從所述觀點(diǎn)出發(fā)，以往β-TCP單獨(dú)作為骨補(bǔ)充材料使用。但是，Altermatt等在出版物(Eur.J.Pediatr.Surg.2，180～182)中報(bào)道了經(jīng)觀察，多孔β-TCP應(yīng)用于骨囊腫時(shí)，作為材料，在補(bǔ)充部位最長可以存在7年。β-TCP雖然具有可被吸收的性質(zhì)，但還有長期存在的情況，β-TCP不是根本意義上的理想材料。
實(shí)際使用中β-TCP的純度也是個(gè)問題。β-TCP一般的制作方法有干式的通過使碳酸鈣和磷酸鈣發(fā)生固相反應(yīng)的方法，濕式的使鈣離子和磷離子反應(yīng)的方法。
但是，干式方法因?yàn)榉磻?yīng)不是均質(zhì)的，殘留一定的未反應(yīng)物，生成的粉末缺乏燒結(jié)特性。濕式方法中必需精確的控制溫度和pH，Ca和P的比例與化學(xué)理論量略有不同就會(huì)含有微量的副產(chǎn)物。原料的性質(zhì)受制造工藝的影響很大，其制造工藝差會(huì)導(dǎo)致在使用階段出現(xiàn)所不希望的結(jié)果，而以往對(duì)所述影響完全沒有研究。并且形成多孔β-TCP的氣孔形狀也是影響骨傳導(dǎo)能力和吸收性的因素。

發(fā)明內(nèi)容
基于以上事實(shí)，本發(fā)明的目的是通過復(fù)合β-TCP和培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，提供促進(jìn)骨形成的理想人工骨骼材料。
為了達(dá)到上述目的，權(quán)利要求1的發(fā)明的人工骨骼材料的特征為，在β-磷酸鈣形成的多孔陶瓷的內(nèi)部植入骨髓細(xì)胞。
權(quán)利要求2的發(fā)明是如權(quán)利要求1所述的人工骨骼材料，其特征為，所述骨髓細(xì)胞中還復(fù)合了提供骨形成的細(xì)胞增殖因子。
權(quán)利要求3的發(fā)明是如權(quán)利要求1所述的人工骨骼材料，其特征為，所述多孔陶瓷的氣孔率為60～90％，具有多個(gè)氣孔連同的50～1000μm大小的巨型氣孔和2μm以下的微型氣孔。
權(quán)利要求4的發(fā)明是如權(quán)利要求1或3所述的人工骨骼材料，其特征為，所述多孔陶瓷使用通過機(jī)械化學(xué)方法合成的β-磷酸鈣粉末作為原料，成形后燒結(jié)處理形成。
權(quán)利要求5的發(fā)明是如權(quán)利要求1或2所述的人工骨骼材料，其特征為，所述骨髓細(xì)胞是從患者身上采取培養(yǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞。
權(quán)利要求6的發(fā)明是如權(quán)利要求5所述的人工骨骼材料，其特征為，在培養(yǎng)中對(duì)所述培養(yǎng)細(xì)胞給予電或/和機(jī)械刺激。
權(quán)利要求7的發(fā)明是如權(quán)利要求5或6所述的人工骨骼材料，其特征為，所述培養(yǎng)細(xì)胞通過下述(a)～(c)中的至少一種方法或組合的方法播種到多孔陶瓷的內(nèi)部。
(a)減壓或加壓下播種培養(yǎng)細(xì)胞。
(b)反復(fù)減壓和加壓播種培養(yǎng)細(xì)胞。
(b)利用離心力播種培養(yǎng)細(xì)胞。
具體實(shí)施形式本發(fā)明的人工骨骼材料是，通過播種，在由β-TCP形成的陶瓷內(nèi)部植入骨髓細(xì)胞的物質(zhì)。多孔陶瓷的形狀可以是塊狀或顆粒狀。
使細(xì)胞侵入到多孔陶瓷的中心部分過程中，向多孔陶瓷材料播種培養(yǎng)骨髓細(xì)胞時(shí)，為了有效地播種，可以在減壓或加壓的情況下進(jìn)行，或在反復(fù)減壓和加壓的情況下進(jìn)行，或利用離心力的作用進(jìn)行。這樣可以使骨髓細(xì)胞進(jìn)入到多孔陶瓷的中心部分。此時(shí)，組合幾個(gè)所述的方法可以更加有效。
另外，通過細(xì)胞培養(yǎng)中施加電或機(jī)械刺激，例如施加電場、增加各向同性壓力，增加沖擊波等，可以增加細(xì)胞的增殖性，從而可以維持細(xì)胞活性。
通過將VEGF等血管新生的誘導(dǎo)因子復(fù)合在骨髓細(xì)胞上，使多孔陶瓷的內(nèi)部的血管新生成為可能。此時(shí)，優(yōu)選通過使用VEGF的表達(dá)載體導(dǎo)入基因進(jìn)行復(fù)合。
另外，除了培養(yǎng)細(xì)胞，不僅復(fù)合VEGF，還復(fù)合提供骨形成的細(xì)胞增殖因子，從而可以更好的實(shí)現(xiàn)骨形成。例如，通過使用BMP、FGF、TGF-β、IGF、PDGF等提供骨形成的細(xì)胞增殖因子可以確保骨形成。
復(fù)合β-TCP形成的多孔陶瓷和培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的人骨骼材料以促進(jìn)骨形成。該人工骨骼材料中，作為β-TCP，使用高純度的具有優(yōu)異骨傳導(dǎo)能力和吸收性的材料。
由β-TCP形成的多孔陶瓷具有多個(gè)氣孔連通的巨型氣孔和比此巨型氣孔小的微型氣孔，其氣孔率優(yōu)選60～90％。作為巨型氣孔，大小優(yōu)選在50～1000μm，更優(yōu)選在100～500μm。作為巨型氣孔，優(yōu)選容積率為全部氣孔的30～70％左右。該巨型氣孔可以提供骨髓細(xì)胞向陶瓷內(nèi)侵入和血管新生的空間。
微型氣孔優(yōu)選大小在2μm以下，更優(yōu)選在1μm以下。另外，微型氣孔優(yōu)選容積率占全氣孔的10～40％左右。該微型氣孔具有促進(jìn)使吸收容易的化學(xué)作用。
高純度的β-TCP是利用濕式粉碎的機(jī)械化學(xué)法制造的，其可以作為用于骨組織的代替材料的材料成分。所述機(jī)械化學(xué)法具體如下所述，稱取碳酸鈣和磷酸氫鈣二水合物，Ca和P的摩爾比為1.5，采用濕式粉碎，將該粉末在球磨機(jī)中粉碎，得到泥漿狀混合物，將該泥漿狀混合物干燥，然后在720℃～900℃焙燒，得到β-TCP。通過該方法可以在原料的稱量上控制Ca和P的比例，得到純度高且燒結(jié)性優(yōu)異的β-TCP。
由具有優(yōu)異的骨傳導(dǎo)能力和吸收性的β-TCP形成的多孔陶瓷的方法如下所述。向通過濕式粉碎方法得到的β-TCP粉末中加入表面活性劑(散凝劑)，濕式發(fā)泡成型后干燥處理，于950℃～1050℃焙燒成多孔體。通過該方法可以得到氣孔率為60～90％，具有多個(gè)氣孔連通的50～1000μm大小的巨型氣孔，其容積率為總氣孔的30～70％，并且具有2μm以下的微型氣孔，其容積率為總氣孔的10～40％的多孔陶瓷。
復(fù)合由上述的β-TCP形成的多孔陶瓷和培養(yǎng)骨髓細(xì)胞制成的人工骨骼材料可以作為很好的促進(jìn)骨形成的人工骨骼材料。
實(shí)施例1稱取摩爾比為1∶2的碳酸鈣粉末和磷酸氫鈣二水合物，并與純水一起投入到球磨機(jī)缽中，用球磨機(jī)混合粉碎約1天。在約80℃干燥得到的泥漿狀混合物，然后在750℃焙燒。得到的粉末是燒結(jié)性優(yōu)異、純度高的β-TCP陶瓷。
向該粉末中加入純水和丙烯酸銨類散凝劑與聚氧乙烯烷基苯基醚類表面活性劑，混合攪拌，配制發(fā)泡泥漿。干燥該發(fā)泡泥漿，然后在150℃焙燒，得到β-TCP多孔陶瓷。該多孔陶瓷的氣孔率為75％，氣孔孔徑分布在100～500μm和1～0.1μm的2個(gè)范圍。
實(shí)施例2以實(shí)施例1制作的β-TCP多孔陶瓷作為基礎(chǔ)材料，播種來源于骨髓的成骨細(xì)胞的第一代培養(yǎng)細(xì)胞，體外培養(yǎng)，形成骨形成種子的骨組織，植入生物體，從植入的組織形成大量的骨組織。具體方法如下所述。
采取骨髓細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中，MEM培養(yǎng)基中加入10～15％的FBS(牛胎兒血清)，5％CO2下，在37℃培養(yǎng)10天左右。然后通過胰蛋白酶處理，從培養(yǎng)瓶中分離細(xì)胞，接著播種到由β-TCP形成的塊狀多孔陶瓷中。培養(yǎng)基使用加入10～15％的FBS(牛胎兒血清)的MEM培養(yǎng)基。
對(duì)5mm×5mm×5mm的塊狀多孔陶瓷播種時(shí)，細(xì)胞濃度為1cc的培養(yǎng)基中含有100萬個(gè)或100萬個(gè)以上的細(xì)胞。在5％CO2下，于37℃恒溫培養(yǎng)1-3小時(shí)后，更換培養(yǎng)基，在加有10-15％FBS(牛胎兒血清)的MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上追加10-8M的地塞米松、10mM的β-甘油磷酸酯、50μg/ml的抗壞血酸，每2日進(jìn)行一次追加，在5％CO2下，于37℃恒溫培養(yǎng)2周左右。然后將各多孔陶瓷塊植入生物體內(nèi)。
其后，從fisher大鼠的大腿骨采取骨髓液，用上述方法培養(yǎng)該骨髓液，播種到由β-TCP多孔陶瓷形成的塊料上，培養(yǎng)2周后，植入到其他的fisher大鼠的皮下，3周后取出。通過HE染色研究證明骨形成良好。
實(shí)施例3使實(shí)施例1制作的β-TCP多孔陶瓷上吸附細(xì)胞增殖因子進(jìn)行播種。作為細(xì)胞增殖因子，分別使用VEGF、BMP、FGF、FGF-β、IGF、PDGF。體外培養(yǎng)，形成骨形成種子的骨組織，植入生物體，從植入的組織形成大量的骨組織。具體方法如下所述。
分別采取上述細(xì)胞增殖因子，接種到培養(yǎng)瓶中，MEM培養(yǎng)基中加入10～15％的FBS(牛胎兒血清)，在5％CO2下，在37℃培養(yǎng)10天左右。然后通過胰蛋白酶處理，從培養(yǎng)瓶中分離細(xì)胞，接著播種到由β-TCP形成的塊狀多孔陶瓷中。培養(yǎng)基使用加入10～15％的FBS(牛胎兒血清)的MEM培養(yǎng)基。
播種時(shí)，各細(xì)胞增殖因子的播種方法分別采用減壓下播種、加壓下播種和反復(fù)減壓加壓下播種的方法，同時(shí)采用利用離心力作用的播種方法，制作各播種條件的試驗(yàn)體。
對(duì)5mm×5mm×5mm的塊狀多孔陶瓷播種時(shí)，細(xì)胞增殖因子的濃度為1cc的培養(yǎng)基中含有100萬個(gè)或100萬個(gè)以上的細(xì)胞。在5％CO2下，于37℃恒溫培養(yǎng)1-3小時(shí)后，更換培養(yǎng)基，在加有10-15％FBS(牛胎兒血清)的MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上追加10-8M的地塞米松、10mM的β-甘油磷酸酯、50μg/ml的抗壞血酸，每2日進(jìn)行一次追加，在5％CO2下，于37℃恒溫培養(yǎng)2周左右。然后將各多孔陶瓷塊植入生物體內(nèi)。
其后，從fisher大鼠的大腿骨采取骨髓液，用上述方法培養(yǎng)該骨髓液，播種到由β-TCP多孔陶瓷形成的塊料上，培養(yǎng)2周后，植入到其他的fisher大鼠的皮下，3周后取出。通過HE染色研究證明骨形成良好。
如上所述，通過本發(fā)明，在β-TCP多孔陶瓷中植入骨髓細(xì)胞可以提供能夠很好地促進(jìn)骨形成的人工骨骼材料。另外，通過各向同性壓力等機(jī)械刺激或復(fù)合VEGF等細(xì)胞增殖因子，可以確保骨形成，從而進(jìn)一步提高實(shí)用性。
權(quán)利要求
1.一種人工骨骼材料，其特征為，在β-磷酸鈣形成的多孔陶瓷的內(nèi)部植入骨髓細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的人工骨骼材料，其特征為，所述骨髓細(xì)胞中還復(fù)合了提供骨形成的細(xì)胞增殖因子。
3.如權(quán)利要求1所述的人工骨骼材料，其特征為，所述多孔陶瓷的氣孔率為60～90％，具有多個(gè)氣孔連通的50～1000μm大小的巨型氣孔和2μm以下的微型氣孔。
4.如權(quán)利要求1或3所述的人工骨骼材料，其特征為，所述多孔陶瓷使用通過機(jī)械化學(xué)方法合成的β-磷酸鈣粉末作為原料，成形后燒結(jié)處理形成。
5.如權(quán)利要求1或2所述的人工骨骼材料，其特征為，所述骨髓細(xì)胞是從患者身體采取培養(yǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的人工骨骼材料，其特征為，在培養(yǎng)中對(duì)所述培養(yǎng)細(xì)胞給予電或/和機(jī)械刺激。
7.如權(quán)利要求5或6所述的人工骨骼材料，其特征為，所述培養(yǎng)細(xì)胞通過下述(a)～(c)中的至少一種方法或組合的方法播種到多孔陶瓷的內(nèi)部(c)減壓或加壓下播種培養(yǎng)細(xì)胞；(b)反復(fù)減壓和加壓播種培養(yǎng)細(xì)胞；(d)利用離心力播種培養(yǎng)細(xì)胞。
全文摘要
在由β－磷酸鈣形成的多孔陶瓷內(nèi)部植入骨髓細(xì)胞，提供人體相容性良好的有利于骨形成的人工骨骼材料。
文檔編號(hào)A61L27/56GK1501818SQ02807099
公開日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2002年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月23日
發(fā)明者袴塚康治, 入江洋之, 井上晃, 増渕良司, 岡部洋, 植村壽公, 之, 公, 司, 康治 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社, 獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所