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信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法

發(fā)布時(shí)間:2025-04-27

專利名稱:信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體的說,本發(fā)明涉及一種信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白 α (SIRPa)在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細(xì)胞中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
腫瘤中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞又稱腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages, TAMs)是浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞的主要成分。研究表明腫瘤細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子等從外周血中募集單核細(xì)胞到達(dá)腫瘤局部,誘導(dǎo)分化形成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要作用,主要包括形成慢性炎癥的微環(huán)境,降解細(xì)胞外基質(zhì),腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn),進(jìn)入血管,促進(jìn)血管生成,在遠(yuǎn)隔部位種植等0 (John Condeelis, Jeffrey W. Pollard. Macrophages :0bligate Partners for Tumor Cell Migration,Invasion, and Metastasis. Cell. 124 :263-266.)信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α (SIRPa)屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員,是一類主要表達(dá)在骨髓細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的胞膜蛋白,此外在平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等也有少量表達(dá)。 SIRPa胞外區(qū)由三個(gè)免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域(IgSF)組成,通常被高度糖基化,結(jié)構(gòu)學(xué)研究顯示它與抗原受體如TCR和BCR在非常類似,提示SIRPs家族分子可能是機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)化的重要一環(huán),參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活化。SIRPa胞質(zhì)區(qū)在人、大鼠和小鼠之間高度保守, 具有富含酪氨酸殘基的免疫受體抑制基序(ITIMs),可以被蛋白激酶如Src蛋白磷酸化,進(jìn)而與含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白如酪氨酸磷酸酶SHP-I和SHP-2結(jié)合,抑制免疫細(xì)胞的激活。 目前普遍認(rèn)為SIRPa是一類抑制性受體。已有文獻(xiàn)報(bào)道SIRP α可以抑制LPS刺激引起的巨噬細(xì)胞活化,抑制中性粒細(xì)胞的遷移等。然而一部分研究證明SIRP α亦可以發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用,例如巨噬細(xì)胞SIRPa與配體結(jié)合后可以促進(jìn)JAK-STAT的活化并促進(jìn)NO的形成。 (Jacqueline Alblas. Signal Regulatory Protein Ligation Induces Macrophage Nitric Oxide Production through JAK/STAT-and Phosphatidylinositol 3-Kinase/Racl/NAPDH 0xidase/H202-Dependent Pathways. MOL CELL BIOL. 25 :7181-7192)慢病毒載體指以人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)來源的一種病毒載體,能夠穩(wěn)定高效的將外源基因整合到宿主染色體上,實(shí)現(xiàn)持續(xù)性表達(dá)。慢病毒載體可以克服脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差,持續(xù)時(shí)間短等缺點(diǎn),已廣泛應(yīng)用與生物學(xué)研究中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α的新用途,特別是提供一種通過慢病毒載體介導(dǎo)上調(diào)巨噬細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α (SIRPa)的表達(dá),調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的功能, 達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的作用。本發(fā)明提供了信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白a (SIRPa)在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細(xì)胞中的應(yīng)用。具體是通過構(gòu)建SIRPa過表達(dá)的慢病毒載體,體外轉(zhuǎn)染分離獲得的巨噬細(xì)胞,獲得過表達(dá)SIRPa的巨噬細(xì)胞,用于預(yù)防和治療腫瘤。本發(fā)明的技術(shù)方案主要包括以下幾個(gè)方面1、慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建LV-WT-SIRP α、LV-microRNA-SIRP α、LV-GFP2、表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細(xì)胞,包裝慢病毒,滴度檢測(cè);3、分離培養(yǎng)外周單核細(xì)胞,骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDMs),腫瘤局部的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs);4、慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞;5、體外觀察腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)條件下SIRP α過表達(dá)與干擾的巨噬細(xì)胞(a)細(xì)胞表型的改變-流式檢測(cè)MHC II ;(b)遷移粘附到腫瘤局部-Transwell能力,細(xì)胞骨架改變,粘附相關(guān)分子表達(dá);(c)表達(dá)分泌腫瘤炎癥與免疫相關(guān)分子-Real-Time與ELISA檢測(cè)IL-6、 TNFa、IL-12、IL-10等;(d)微環(huán)境中生存能力的改變-PI/Annexin V染色,Caspase相關(guān)分子的改變。6、體外觀察腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)條件下SIRP α過表達(dá)與干擾的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAMs)研究?jī)?nèi)容同5 ;7、體外觀察SIRP α過表達(dá)與干擾的巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)(a)巨噬細(xì)胞表面分子的改變-流式檢測(cè)TRAIL、FasL ; (b)腫瘤細(xì)胞凋亡-PI/Annexin V染色,Caspase相關(guān)分子改變。(c)腫瘤細(xì)胞增殖-CCK-8檢測(cè);8、體內(nèi)觀察SIRPa過表達(dá)與干擾的巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤的影響在預(yù)防和治療腫瘤模型中定期注射慢病毒載體介導(dǎo)的SIRPa過表達(dá)與干擾的巨噬細(xì)胞,觀察對(duì)腫瘤大小和小鼠生存時(shí)間的影響。本發(fā)明提供了信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α (SIRPa)的新用途。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1)如圖2所示,巨噬細(xì)胞SIRPa負(fù)性調(diào)控其向腫瘤細(xì)胞的遷移。與無H印al_6 細(xì)胞條件相比,巨噬細(xì)胞與ifepal-6細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)向!fepal-6遷移的能明顯增強(qiáng),低表達(dá) SIRPa促進(jìn)巨噬細(xì)胞的這種遷移能力。2)如圖3所示,巨噬細(xì)胞SIRP α負(fù)性調(diào)控腫瘤炎癥微環(huán)境。圖3_1與3_2說明腫瘤微環(huán)境刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-6、TNF a、ILl β等炎性因子,低表達(dá)SIRP α的BMDMs分泌炎性因子的能力強(qiáng)于對(duì)照組,。圖3-3說明SIRP α調(diào)控BMDMs與炎癥和免疫相關(guān)的信號(hào)通路。3)如圖4所示,巨噬細(xì)胞SIRP α負(fù)性調(diào)控細(xì)胞存活。低表達(dá)SIRP α的BMDMs在相應(yīng)刺激下PARP與Caspase-3剪切體的表達(dá)低于對(duì)照組。4)如圖5顯示,巨噬細(xì)胞SIRP α負(fù)性調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)。圖5_1顯示高表達(dá)SIRP a 的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清明顯抑制B16F10腫瘤的生長(zhǎng),圖5-2顯示回輸慢病毒載體介導(dǎo)的高表達(dá)SIRP α的BMDMs抑制B16F10的生長(zhǎng)。圖5_3顯示回輸慢病毒載體介導(dǎo)的高表達(dá)SIRP a 的巨噬細(xì)胞抑制H印al-6的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明巨噬細(xì)胞SIRPa負(fù)性調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明提供了一種利用慢病毒載體針對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的方法,可以用于預(yù)防和治療小鼠肝癌、黑色素瘤等腫瘤,進(jìn)而可以預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物腫瘤,特別是與巨噬細(xì)胞相關(guān)的腫瘤如肝癌、乳腺癌等。本發(fā)明為SIRPa的臨床應(yīng)用提供了新的思路。本發(fā)明提供了一種新型的腫瘤治療方案。


圖1是慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及包裝、感染。SIRP α表達(dá)特異性檢測(cè)。其中圖1-1 為 Western-Blot 檢測(cè) LV-WT-SIRP α、LV-miRNA-SIRP α、LV-GFP 質(zhì)粒包裝的慢病毒的感染效果;圖1-2為Wfestern-Blot檢測(cè)LV-miRNA-SIRP α包裝的慢病毒的不同滴度的感染效果以及腫瘤細(xì)胞Hepal-6表達(dá)SIRP α的情況。圖2是SIRP α與巨噬細(xì)胞遷移到腫瘤局部的能力其中圖2-1是利用Transwell方法,光鏡下觀察BMDMs KD Control組與!fepal-6 細(xì)胞共培養(yǎng)10hr、20hr后的遷移能力;圖2_2是對(duì)圖2_1的各組細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖3是SIRP α調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的表型其中圖3-1為高低表達(dá)SIRP α的巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)后IL_6、TNF α、 IL10、IL12等細(xì)胞因子的表達(dá)情況;圖3-2為ELISA檢測(cè)高低表達(dá)SIRP α的巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)后IL-6、TNFa、IL10、IL12的水平;圖3_3為高低表達(dá)SIRP α的巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)后相應(yīng)信號(hào)通路的改變。圖4是SIRP α調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞存活的能力其中圖4-1是干擾SIRP α表達(dá)和對(duì)照的巨噬細(xì)胞在IFN γ誘導(dǎo)下發(fā)生凋亡情況。 分別檢測(cè)了參與凋亡途徑的caSpaSe3和PARP剪切情況;圖4-2是干擾SIRP α表達(dá)和對(duì)照的巨噬細(xì)胞在TNF+CHX的作用下發(fā)生凋亡情況,實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了 CaSpaSe3和PARP剪切情況。圖5是SIRP α調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的能力其中圖5-1為高低表達(dá)SIRP α的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)上清與B16F10腫瘤生長(zhǎng)的能力;圖5-2為體內(nèi)回輸高低表達(dá)SIRP α的巨噬細(xì)胞與B16F10腫瘤生長(zhǎng)的能力;圖5_3為高低表達(dá)SIRP α的巨噬細(xì)胞與!fepal-6細(xì)胞皮下接種C57小鼠后瘤體生長(zhǎng)的能力。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖,對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的實(shí)施并不僅限于此。實(shí)施例1 :SIRPa表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及干擾序列的合成、鑒定;SIRP α特異性表達(dá)檢測(cè)材料1) SIRP α慢病毒表達(dá)載體與干擾載體和包裝載體Lenti-Linker、VSVG, PACK,線性化載體 pcDNA6. 2-Gff/miR 購(gòu)自 hvitrogen 公司;2)克隆引物為鼠源SIRP α mRNA開放閱讀框起始和終止引物序列,委托上海生工合成。3)克隆過程使用限制性內(nèi)切酶和Τ4連接酶購(gòu)自NEB公司。4) 293Τ, Hepal-6細(xì)胞系購(gòu)自上海市中科院細(xì)胞所。
5) M-CSF等細(xì)胞因子購(gòu)自P^rotech公司6)轉(zhuǎn)染試劑 PEI 購(gòu)自 Polyplus-transfection 公司。7)兔抗鼠多克隆抗體SIRPa由本實(shí)驗(yàn)室自行制備(參見Kharitonenkov A. Afamily of proteins that inhibit signalling through tyrosine kinase receptors. Nature. 1997Mar 13 ;386 (6621) :181-6.)。方法1)慢病毒表達(dá)載體與干擾載體構(gòu)建、鑒定1. 1構(gòu)建干擾慢病毒載體LV-miRNA-SIRP α構(gòu)建慢病毒干擾載體LV-microRNA-SIRP α,設(shè)計(jì)干擾引物,引物序列如下上游TGCTGTCTATGAGCAGATGAGTTCACGTTTTGGCCACTGACTGACGTGAACTCCTGCTCATAG(SEQ ID NO 1)下游 CCTGTCTATGAGCAGGAGTTCACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTGAACTCATCTGCTCATAGAC(SEQ ID NO 2)引物于95 °C退火5min,冷卻至常溫形成二聚體。T4連接酶連接至pcDNA6. 2-Gff/miSIRP α制備干擾質(zhì)粒。再以該質(zhì)粒為模版,通過上游引物 GGACTAGTGCAGATATCAACAAGTTTG(SEQ ID NO 3)(帶 Spe 1 酶切位點(diǎn)),和下游引物 GGACT AGTCTGCGGCCGCACCACTTTGTACAAGAAAGTCGG(SEQ ID NO 4)(帶 Spel 酶切位點(diǎn))PCR 擴(kuò)增 GFP-miSIRP α片段,得到約900bp的片段,經(jīng)Spel單酶切后連入NheI和SpeI雙酶切的 pLenti-linker1. 2構(gòu)建過表達(dá)慢病毒載體LV-WT-SIRP α以小鼠cDNA為模版,設(shè)計(jì)相應(yīng)引物PCR獲得目的片段。引物序列如下上游GGATCCATGGAGCCCGCCGGCCCG(SEQID NO 5)(帶 BamHI 酶切位點(diǎn))下游GCTAGCTCACTTCCTCTGGACCTGGACACT(SEQID NO 6)(帶 NheI 酶切位點(diǎn))使用高保真KOD酶體系擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)序列約1500bp,BamHl與NheI雙酶切表達(dá)載體和目的片段,酶切鑒定后,用T4連接酶連接至表達(dá)載體。幻慢病毒包裝,滴度檢測(cè)細(xì)胞在IOcm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至70%匯合度,采用磷酸鈣法(參照分子克隆,第三版,1282-1287頁)共轉(zhuǎn)慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒,60hr后收集培養(yǎng)上清,測(cè)定病毒滴度,具體方法如下傳四31~細(xì)胞IX IO5于M孔板,用無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液1 10、 1 100、1 1000加入M孔板,感染體積為200 μ 1。感染60hr后,收集細(xì)胞經(jīng)流式計(jì)數(shù)鑒定。病毒滴度公式計(jì)算為滴度(/ml)比例% X(IXlO5)X稀釋倍數(shù)/培養(yǎng)體積ml。3)干擾效果檢測(cè)分離小鼠骨髓細(xì)胞,M-CSF 100ng/ml培養(yǎng)7天,分化成熟形成巨噬細(xì)胞(BMDMs), 1 X IO6/孔傳至6孔板,使用干擾SIRP α慢病毒,選定MOI值為50,80,感染8hr后換液,感染60hr后觀察感染效率,Western-Blot檢測(cè)效果。4) SIRP α特異性表達(dá)檢測(cè)本發(fā)明中腫瘤模型建立在H印al-6等腫瘤細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,因此flfestern-Blot檢測(cè)H印al-6細(xì)胞SIRP α的表達(dá)情況。結(jié)果如圖1所示,通過flfestern-Blot檢測(cè),LV_WT_SIRP α包裝的過表達(dá)慢病毒能夠有效的提高巨噬細(xì)胞SIRP α的表達(dá),同時(shí)LV-miRNA-SIRPa包裝得到的慢病毒能下調(diào)巨噬細(xì)胞SIRP α的表達(dá)。如圖1-2所示,當(dāng)MOI =40時(shí),巨噬細(xì)胞可以獲得較好的干擾效果,因此以下實(shí)驗(yàn)建立在此干擾效率的基礎(chǔ)上。同時(shí)圖1-2顯示,與BMDMs相比,!fepal-6細(xì)胞的 SIRPa表達(dá)量很低,說明SIRPa主要表達(dá)于BMDMs,具有較好的特異性。實(shí)施例2 =SIRPa與巨噬細(xì)胞遷移到腫瘤局部能力材料DTranswell 24 孑L板,0. 8 μ m,購(gòu)自 Corning 公司2)0. 結(jié)晶紫、0.4%多聚甲醛購(gòu)自國(guó)藥公司3)!fepal-6細(xì)胞購(gòu)自上海市中科院細(xì)胞所4) C57/BL6小鼠購(gòu)自中科院方法分離培養(yǎng)C57小鼠的BMDMs,腫瘤細(xì)胞Hepal-6種植于Transwell下室,BMDMs SIRPaKD, Control組細(xì)胞種植于細(xì)胞上室,加入無血清DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)10hr、20hr后 0.4%多聚甲醛固定BMDM細(xì)胞15min,0. 結(jié)晶紫染色15-30min,生理鹽水洗凈后鏡下觀察,每孔在100X視野條件下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)取均值為該孔細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖2-1與圖2-2所示,無腫瘤細(xì)胞存在條件下,差異表達(dá)SIRPa的BMDMs遷移能力沒有明顯差別。在與ifepal-6細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),巨噬細(xì)胞向ifepal-6遷移的能明顯增強(qiáng), SIRPa抑制巨噬細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的遷移。說明SIRPa負(fù)性調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向腫瘤局部遷移的能力。實(shí)施例3 =SIRP α調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的表型材料l)mIL_6、mTNFa、mILlO、mIL12 等引物由生工公司合成,2) Sybr-Green 購(gòu)自 TaKaRa 公司3)mIL-6、mTNFa、mILlO、mIL12 等 ELISA 試劑盒購(gòu)自達(dá)科為公司4)B16細(xì)胞購(gòu)自中科院5) TRIZOL 購(gòu)自 Invitrogen 公司6) M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系購(gòu)自Promega公司7)p-statl、p-stat3、IkBa、N0S2 等抗體購(gòu)自 Cell signaling technology 公司方法1)H印al_6、B16 細(xì)胞與 BMDMs SIRP α KD,Control 細(xì)胞共培養(yǎng) 12M36hr,收取培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè),同時(shí)收取BMDMs的RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)cDNA,通過Real-Time檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。2) BMDMs與!fepal-6細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)0、l、3Jhr,收取蛋白,Western-Blot檢測(cè)相關(guān)分子的表達(dá)情況。結(jié)果圖3-1與圖3-2分別從mRNA與蛋白水平顯示腫瘤微環(huán)境能夠刺激巨噬細(xì)胞分泌 IL_6、TNFa、ILli3等炎性因子,低表達(dá)SIRP α的BMDMs分泌炎性因子的能力強(qiáng)于對(duì)照組, 提示低表達(dá)SIRPa可以促進(jìn)腫瘤炎癥環(huán)境。
圖3-3顯示SIRP α調(diào)控BMDMs細(xì)胞與炎癥和免疫相關(guān)的信號(hào)通路,低表達(dá)SIRP α 可以增強(qiáng)乂&13、11^(1的磷酸化與,抑制Matl的磷酸化與N0S2的表達(dá),提示SIRP α可以抑制巨噬細(xì)胞腫瘤相關(guān)的免疫功能。實(shí)施例4 =SIRP α與巨噬細(xì)胞存活的關(guān)系材料1) mTNF α、mIFN γ 訂購(gòu)自 ρ印rotech 公司2) Caspase-3、PARP 抗體購(gòu)自 CST 公司方法DBMDMs SIRP α KD 和 Control 組細(xì)胞 CHX lng/ml 預(yù)處理過夜,TNF α 10ng/ml 刺激 0、6、12hr,收取蛋白 Western-Blot 檢測(cè) Caspase-3、PARP 的表達(dá);2) IFNy 100ng/ml 朿Ij 激 BMDMs SIRP α KD Control 組細(xì)胞 0243648hr, Western-Blot 檢測(cè) Caspase-3> PARP 的表達(dá)。結(jié)果如圖4-1 所示,低表達(dá) SIRP α 的 BMDMs 在 CHX+TNF α 刺激下,PARP 與 Caspase-3 剪切體的表達(dá)低于對(duì)照組,提示SIRP α促進(jìn)CHX+TNFa引起的細(xì)胞凋亡。圖4-2顯示低表達(dá)SIRP α的BMDMs抑制IFN γ誘導(dǎo)的PARP與Caspase-3剪切體的表達(dá),提示SIRP α促進(jìn)IFN γ引起的細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果提示,SIRPa負(fù)性調(diào)節(jié)有害刺激引起的細(xì)胞凋亡。實(shí)施例5 =SIRPa與腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的關(guān)系材料l)C57/BL6、Balb/c 小鼠購(gòu)自中科院2)Hepal-6,B16F10細(xì)胞系購(gòu)自中科院細(xì)胞所方法1)B16F10 細(xì)胞 5\105接種8&讓/(;小鼠腹腔,同時(shí)收集B16F10 與 BMDMs SIRPa KD, Control細(xì)胞共培養(yǎng)上清,待腫瘤接種5天后,腹腔注射KD、Control上清250ul/只/天, 連續(xù)12天后,小鼠活體成像檢測(cè)腫瘤大??;2) B16F10細(xì)胞5 X IO5接種Balb/c小鼠腹腔,同時(shí)體外分離小鼠BMDMs,干擾 SIRPa表達(dá),待腫瘤接種5天后,將BMDMs SIRP a KD,Control 2 X IO6回輸小鼠體內(nèi),待12 天后活體成像檢測(cè)腫瘤大?。?)!1印&1-6細(xì)胞與腦01^ SIRP a KD,Control 細(xì)胞 1 :1 共 5 X IO6 皮下注射 C57/BL6 小鼠,并在相應(yīng)時(shí)間測(cè)量腫瘤的大小。結(jié)果圖5-1顯示,低表達(dá)SIRPa的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠明顯促進(jìn)B16F10腫瘤的生長(zhǎng),圖5-2顯示低表達(dá)SIRP α的BMDMs與B16F10共培養(yǎng)后亦能促進(jìn)B16F10的生長(zhǎng)。圖 5-3顯示,低表達(dá)SIRPa的巨噬細(xì)胞能促進(jìn)H印al_6的生長(zhǎng)。結(jié)果提示,低表達(dá)SIRPa的巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細(xì)胞中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細(xì)胞中的應(yīng)用,其特征在于通過構(gòu)建SIRP α過表達(dá)的慢病毒載體,體外轉(zhuǎn)染分離獲得的巨噬細(xì)胞,獲得過表達(dá)SIRP α的巨噬細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域。腫瘤中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞又稱腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞的主要成分。研究表明腫瘤細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子等從外周血中募集單核細(xì)胞到達(dá)腫瘤局部,誘導(dǎo)分化形成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員,是一類主要表達(dá)在骨髓細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的胞膜蛋白,此外在平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等也有少量表達(dá)。本發(fā)明的目的在于提供信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α的新用途,具體是通過構(gòu)建SIRPα過表達(dá)的慢病毒載體,體外轉(zhuǎn)染分離獲得的巨噬細(xì)胞,獲得過表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞,用于預(yù)防和治療腫瘤。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102335427SQ20111030380
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者潘宇飛, 王紅陽, 董立巍, 談冶雄 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)

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