專(zhuān)利名稱(chēng)：高效血管生成抑制劑的設(shè)計(jì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程制藥技術(shù)領(lǐng)域。
血管生成是指從已有的血管衍生、生長(zhǎng)出新的血管。血管新生在許多人類(lèi)重要疾病，如惡性腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管新生，以及許多皮膚疾病中起著重要作用?？寡苌芍委?，即血管生成抑制療法，是30年前由Judah Folkman博士率先提出的(Folkman，J.N.Engl.J.Med.，285，1182-1186，1971；Folkman，J.Ann.Surg.，175，409-416，1972)。他提出可以通過(guò)切斷腫瘤的血液供應(yīng)，達(dá)到消滅腫瘤的目的。在血管生成的過(guò)程中，有許多調(diào)節(jié)因子在發(fā)揮作用，如生長(zhǎng)因子，細(xì)胞外基質(zhì)分子，細(xì)胞膜結(jié)合的蛋白質(zhì)，生長(zhǎng)因子受體等。目前正在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的抗血管生成藥物一血管生成抑制劑，也可因其作用靶分為內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、血管生成生長(zhǎng)因子拮抗劑等。其中最為著名的為Judah Folkman博士實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制劑angiostatin(O′Reilly，M.S.等，Cell 79，315-328，1994)，endostatin(O′Reilly，M.S.等，Cell88，277-285，1997)，人纖溶酶原kringle 5(Cao，Y.H.等，J.Biol.Chem.272，22924-22928，1997)，以及其它實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的vasostatin，restin，arresten，canstatin，tumstain，prolactin N端16kD片段，troponin I，pigment epithelium derived factor，platelet factor 4等。盡管這些血管生成抑制劑呈現(xiàn)出非常誘人的應(yīng)用前景，但是其缺陷也非常明顯在小鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)時(shí)，angiostatin的使用劑量高達(dá)上百毫克/公斤體重，endostatin的劑量也為幾十毫克/公斤體重，kringle 5的使用劑量也在幾十毫克--上百毫克/公斤體重，據(jù)估計(jì)當(dāng)這些血管生成抑制劑在人體使用時(shí)，使用劑量將達(dá)到至少幾克/人的劑量。這樣大的藥物使用劑量勢(shì)必會(huì)增加今后該類(lèi)藥物毒副作用發(fā)生的可能性，造成該類(lèi)藥物質(zhì)量控制難度加大、生產(chǎn)規(guī)模和生產(chǎn)成本增大、而且藥物價(jià)格居高。
整聯(lián)蛋白(integrin)是由α、β兩個(gè)亞基組成的跨膜蛋白異二聚體，它們通過(guò)和細(xì)胞外基質(zhì)分子的相互作用控制細(xì)胞的遷移、分化和增殖。20多種整聯(lián)蛋白中的大多數(shù)分子都能識(shí)別含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp)或NGR(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸，Asn-Gly-Arg)等序列的細(xì)胞外基質(zhì)配基。一些整聯(lián)蛋白能對(duì)血管生成過(guò)程起調(diào)節(jié)作用，針對(duì)某些整聯(lián)蛋白的抗體也被發(fā)現(xiàn)具有抑制血管新生的作用。
血管生成是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，正在新生的血管具有多種分子標(biāo)記，而非單一的標(biāo)記，使它們區(qū)別于已經(jīng)生成的血管。因此一個(gè)好的抗血管生成的血管生成抑制劑應(yīng)該具有對(duì)新生血管的多種標(biāo)記分子的選擇性，這樣才能達(dá)到對(duì)新生血管具有導(dǎo)向性、選擇性作用的效果；對(duì)新生血管多個(gè)標(biāo)記分子或靶點(diǎn)同時(shí)發(fā)生作用，將會(huì)從總體上提高藥物對(duì)血管生成的抑制作用；而對(duì)新生血管多靶點(diǎn)，和導(dǎo)向性、選擇性的作用結(jié)果就能導(dǎo)致只要使用較低劑量藥物，就能高效地發(fā)揮抗血管生成的作用。迄今為止的抗血管生成藥物，諸如上述的angiostatin、endostatin、kringle 5等都只針對(duì)新生血管的單一靶點(diǎn)進(jìn)行作用的分子，它們對(duì)血管的專(zhuān)一性和選擇性尚嫌不夠、對(duì)新生血管生成的抑制也只是從一個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行單兵作戰(zhàn)、效果有限，所以結(jié)果導(dǎo)致需要如此高的使用劑量。
本發(fā)明的目的是研制一種新的高效血管生成抑制劑，即構(gòu)建一種對(duì)整聯(lián)蛋白(integrn)具有結(jié)合作用的血管生成抑制劑，使現(xiàn)有的血管生成抑制劑具有對(duì)整聯(lián)蛋白的親和性或結(jié)合能力，賦予現(xiàn)有血管生成抑制劑以整聯(lián)蛋白的親和性。該種高效血管生成抑制劑能夠顯著提高現(xiàn)有的血管生成抑制劑抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及血管新生的活性和效率，提高血管生成抑制劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞及新生血管的特異性和選擇性，降低現(xiàn)有血管生成抑制劑的使用劑量。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到構(gòu)建含有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)或NGR(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸)等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列肽段的血管生成抑制劑(如angiostatin、endostatin，kringle 5等) 基因-即高效血管生成抑制劑基因，可以將該高效血管生成抑制劑基因克隆在基因治療載體中，直接用于基因治療；可以利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行基因工程表達(dá)含RGD或NGR等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列肽段的高效血管生成抑制劑，分離純化重組高效血管生成抑制劑蛋白質(zhì)；或用多肽合成方法合成含有RGD或NGR等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列的肽段，然后用化學(xué)偶聯(lián)的方法將含有RGD或NGR等序列的肽段連接到天然來(lái)源的或重組DNA來(lái)源的血管生成抑制劑上，構(gòu)成能夠和整聯(lián)蛋白具有結(jié)合作用的血管生成抑制劑，即本發(fā)明所述的高效血管生成抑制劑。和整聯(lián)蛋白具有結(jié)合作用的，含有RGD或NGR等序列的肽段可以融合在血管生成抑制劑的N端或C端，或同時(shí)融合在血管生成抑制劑的N端和C端 A肽、B肽分別是長(zhǎng)度為3至90個(gè)氨基酸殘基的、含有RGD或NGR等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列的多肽片段，A肽、B肽分別具有和整聯(lián)蛋白結(jié)合的能力。本發(fā)明所述的高效血管生成抑制劑可顯著提高現(xiàn)有的血管生成抑制劑抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成的生物活性，能夠作為治療疾病的藥物，更有效地治療人或動(dòng)物的、和血管新生相關(guān)的疾病，如惡性腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管新生，以及相關(guān)的皮膚疾病等，或者作用診斷用的藥物，對(duì)人或動(dòng)物的、和血管新生相關(guān)的疾病進(jìn)行定位和診斷。本發(fā)明所述的高效血管生成抑制劑的基因工程生產(chǎn)或多肽合成及化學(xué)偶聯(lián)方法傳統(tǒng)，常規(guī)，簡(jiǎn)單，易行，產(chǎn)量高，對(duì)研制生產(chǎn)高效血管生成抑制劑具有重要的指導(dǎo)意義和實(shí)用價(jià)值。
實(shí)施例11.合成編碼含有RGD或NGR等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列的多肽片段的PCR引物，按血管生成抑制劑基因5’或3’基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得含有RGD或NGR等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列肽段的血管生成抑制劑基因。如合成引物15’CGGGATCGATGACGACGACAAGGCATGCGACTGCCGTG 3’，引物25’GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC 3’，引物35’GCGAATTCTAGGCTGCACACTGAGGGAC 3’。其中，引物1編碼了BamHI位點(diǎn)和腸激酶識(shí)別位點(diǎn)序列，引物2中GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGT編碼了含有RGD序列的肽段，GTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC編碼人纖溶酶原第449-456位氨基酸，即環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5(kringle 5)的N端；引物3編碼人纖溶酶原第538-543位氨基酸。
以人纖溶酶原基因cDNA為模板，以引物2和3為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再以引物1和3為引物，以第一次的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得含有RGD序列的環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5基因，即本發(fā)明所述的高效血管生成抑制劑的一個(gè)分子--高效血管生成抑制劑分子1RGD-Kringle 5(含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5)。該高效血管生成抑制劑分子1RGD-Kringle 5的氨基酸序列為ACDCRGDCFCGVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAA2.為了便于比較本發(fā)明所設(shè)計(jì)的高效血管生成抑制劑分子1--RGD-Kringle5的實(shí)際效果和優(yōu)越之處，本實(shí)例中我們同時(shí)克隆、表達(dá)了不含有RGD序列的環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5，以作為對(duì)照和比較。
分別合成編碼人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5N端和C端的引物，引物45’CGGGATCGATGACGACGACAAGGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC3’，引物4編碼人纖溶酶原第449-456位氨基酸，即環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5的N端，其5’端有腸激酶識(shí)別位點(diǎn)序列編碼序列。以人纖溶酶原基因cDNA為模板，以引物4和3為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5基因。
3.將從1、2中.獲得的基因分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶消解，克隆在各種基因工程表達(dá)載體中，如將從1.中獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI、EcoRI酶切，克隆在大腸桿菌GST融合表達(dá)載體pALEX中，首先進(jìn)行DNA序列分析，驗(yàn)證PCR產(chǎn)物DNA序列的正確性，然后將重組表達(dá)菌分別經(jīng)0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2小時(shí)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析表達(dá)水平。
4.對(duì)3中的表達(dá)菌分別進(jìn)行超聲破碎，分別將超聲上清進(jìn)行Glutathione-Agarose親和層析，收集洗脫峰，一步親和層析純化即可得到較純的GST融合蛋白。對(duì)于獲得的GST-kringle 5和GST-RGD-kringle 5融合蛋白，用腸激酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行切割(酶∶底物＝1∶1000～4000)，兩種融合蛋白經(jīng)37℃酶切10小時(shí)后幾乎均可被切割完全。
GST-Kringle 5和GST-RGD-Kringle 5融合蛋白酶切產(chǎn)物分別再次進(jìn)行Glutathione-Agarose親和層析，收集穿過(guò)峰。獲得的Kringle 5和高效血管生成抑制劑實(shí)例之一RGD-Kringle 5經(jīng)SDS-PAGE電泳和C18反相HPLC驗(yàn)證純度。
5.為了比較Kringle 5和高效血管生成抑制劑實(shí)例之一RGD-Kringle 5的生物活性的差異，我們進(jìn)行了內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)定。在添加10％小牛血清、抗生素及3ng/ml的人重組bFGF(來(lái)源于暨南大學(xué)生物工程研究所)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)ECV304細(xì)胞(人內(nèi)皮細(xì)胞株)。實(shí)驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，樣品的濃度范圍為20nM～1280nM，每個(gè)濃度作3個(gè)重復(fù)，以磷酸緩沖液為空白對(duì)照，37℃，5％CO2，培養(yǎng)48小時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，比較樣品及空白孔中的活細(xì)胞個(gè)數(shù)，以此計(jì)算出不同濃度Kringle 5和高效血管生成抑制劑實(shí)例之一RGD-Kringle 5對(duì)ECV304細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。
結(jié)果顯示重組Kringle 5在320nM時(shí)，對(duì)ECV304細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率為31％，1280nM時(shí)，抑制率為55％；而作為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的高效血管生成抑制劑實(shí)例之一的RGD-Kringle 5在320nM時(shí)，對(duì)ECV304細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率為58％，1280nM時(shí)，抑制率為100％。
從實(shí)例1中，我們可以看到在體外內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的高效血管生成抑制劑實(shí)例之一的RGD-Kringle 5對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性至少是Kringle 5的4倍，其ED50僅為Kringle 5 ED50的四分之一。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的高效血管生成抑制劑確實(shí)顯著提高了現(xiàn)有的血管生成抑制劑Kringle 5的生物活性。
實(shí)施例2Angiostatin是美國(guó)哈佛大學(xué)Folkman博士實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)成功的血管生成抑制因子。Angiostatin含有四個(gè)kringle分子，kringle 1-4，其中kringle 1的對(duì)angiostatin血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性貢獻(xiàn)最大，單獨(dú)的kringle 1血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性占angiostatin血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性的50％以上。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明所設(shè)計(jì)的高效血管生成抑制劑的實(shí)際效果和優(yōu)越之處，本實(shí)例2中我們同時(shí)克隆、表達(dá)了含有RGD序列的環(huán)柄結(jié)構(gòu)環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1(kringle 1)，在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物體內(nèi)對(duì)它們抗血管生成的生物活性進(jìn)行了比較。
1.合成編碼含有RGD或NGR等序列的多肽片段的PCR引物，按血管生成抑制劑基因5’或3’基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得含有RGD或NGR等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列肽段的血管生成抑制劑基因。合成引物15’CGGGATCCATGCCATGGCATGCGACTGCCGTG 3’；引物25’GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGG 3’；引物35’GCGAATTCTAAGCACACTCAAGAATGTCGCAGTAGTC 3’；引物45’CGGGATCCATGCCATGGTGTATCTCTCAGAGTGCAAG 3’。其中，引物1編碼了BamH I和Nco I限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，和起始密碼子ATG；引物2中GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGT編碼了含有RGD序列的肽段，GTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGG編碼人纖溶酶原第80-88位氨基酸，即環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1(kringle 1)的N端8個(gè)氨基酸；引物3編碼人纖溶酶原第157-164位氨基酸，即環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1(kringle 1)的C端9個(gè)氨基酸，和終止密碼子，以及一個(gè)EcoRI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；引物4只含有BamH I和Nco I限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，起始密碼子ATG和一段編碼人纖溶酶原第80-88位氨基酸的序列。
以人纖溶酶原基因cDNA為模板，以引物2和3為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再以引物1和3為引物，以第一次的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得含有RGD序列的環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1基因，即本發(fā)明所述的高效血管生成抑制劑的一個(gè)分子—高效血管生成抑制劑分子2RGD-Kringle 1(含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1)。該高效血管生成抑制劑分子2RGD-Kringle 1的氨基酸序列為ACDCRGDCFCGVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECA；同時(shí)以人纖溶酶原基因cDNA為模板，以引物4和3為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得不含有RGD序列的環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1基因。
2.將從1、2中.獲得的基因分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶消解，克隆在各種基因工程表達(dá)載體中，如將從1.中獲得的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)Nco I、EcoR I酶切，克隆在大腸桿菌非融合表達(dá)載體pNJUTRX-1中，首先進(jìn)行DNA序列分析，驗(yàn)證PCR產(chǎn)物DNA序列的正確性，然后將重組表達(dá)菌分別經(jīng)0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2小時(shí)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析表達(dá)水平。
對(duì)表達(dá)菌分別進(jìn)行超聲破碎，分別將超聲上清進(jìn)行Lysine Sepharose 4B親和層析，用緩沖液(0.5M NaCl，0.5M arginine，20mM Tris-HCl，pH 7.4)進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰，進(jìn)行透析后，一步親和層析純化獲到較純的Kringle 1和RGD-Kringle 1重組蛋白質(zhì)。獲得的Kringle 1和高效血管生成抑制劑實(shí)例之二RGD-Kringle 1經(jīng)SDS-PAGE電泳和C18反相HPLC驗(yàn)證純度，并用牛內(nèi)皮細(xì)胞株BCE細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性實(shí)驗(yàn)，確定重組產(chǎn)物的的生物活性。
5.在接種膀胱移行細(xì)胞癌的腫瘤小鼠動(dòng)物模型上，接種癌細(xì)胞懸液后第五天，進(jìn)行Kringle 1和RGD-Kringle 1抗腫瘤生物活性實(shí)驗(yàn)，重組Kringle 1和RGD-Kringle 1的用量皆為20mg/kg體重/天，腹腔注射，每日一次，以腹腔注射0.1ml生理鹽水組的小鼠為對(duì)照，連續(xù)給藥15天后，測(cè)定小鼠腫瘤的大小和重量，計(jì)算抑瘤率(腫瘤抑制效率)，抑瘤率＝(1-給藥組小鼠平均腫瘤重量/生理鹽水對(duì)照組小鼠平均腫瘤重量)×100％。結(jié)果顯示在20mg/kg體重/天的劑量下，Kringle 1的抑瘤率為8％，而本發(fā)明的高效血管生成抑制劑實(shí)例之二RGD-Kringle 1的抑瘤率為68％，與Kringle 1相比較，RGD-Kringle 1的抑瘤率提高了8倍。
從實(shí)例1和2中，我們可以明顯看到本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和創(chuàng)新。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的具有整聯(lián)蛋白的親和性和結(jié)合能力的高效血管生成抑制劑確實(shí)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都能大幅度地改善和提高現(xiàn)有血管生成抑制劑抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和血管新生的活性和效率，具有很好的、作為治療血管新生相關(guān)疾病(如腫瘤)藥物的前景。實(shí)例1和2有力證明了本發(fā)明設(shè)計(jì)的高效血管生成抑制劑科學(xué)、合理、可行和有效。
權(quán)利要求
1.一種高效血管生成抑制劑，其特征在于該高效血管生成抑制劑是具有整聯(lián)蛋白的親和性和結(jié)合能力的血管生成抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1.所述的高效血管生成抑制劑，其特征在于在血管生成抑制劑分子的一端或兩端分別連接有對(duì)整聯(lián)蛋白具有親和性和結(jié)合能力的肽段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2.所述的高效血管生成抑制劑，其特征在于在血管生成抑制劑分子的一端或兩端分別連接的、對(duì)整聯(lián)蛋白具有親和性和結(jié)合能力的肽段可以是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的段肽，或者是含有天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸序列的段肽，也可以是同時(shí)含有上述兩種序列的肽段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效血管生成抑制劑，其特征在于人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1蛋白質(zhì)上連接有含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的段肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效血管生成抑制劑，其特征在于人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5蛋白質(zhì)上連接有含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的段肽。
6.一種高效血管生成抑制劑的應(yīng)用，其特征在于該種高效血管生成抑制劑能夠顯著提高現(xiàn)有的血管生成抑制劑抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和血管新生的活性和效率，降低現(xiàn)有血管生成抑制劑的使用劑量；該種高效血管生成抑制劑能夠作為治療疾病或者診斷用的藥物，治療人或動(dòng)物的、和血管新生相關(guān)的疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求4和5所述的高效血管生成抑制劑的應(yīng)用，其特征在于該種血管生成抑制劑能夠有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，能夠作為治療疾病或者診斷用的藥物，更有效地治療人或動(dòng)物的、和血管新生相關(guān)的疾病。
8.高效血管生成抑制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于構(gòu)建含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列肽段的血管生成抑制劑基因，將該基因用于基因治療；或進(jìn)行基因工程表達(dá)，分離純化重組蛋白質(zhì)；或用多肽合成方法合成含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列的肽段，然后用化學(xué)偶聯(lián)的方法將含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸等整聯(lián)蛋白結(jié)合序列的肽段連接到天然來(lái)源的或重組DNA來(lái)源的血管生成抑制劑上，構(gòu)成能夠和整聯(lián)蛋白具有結(jié)合作用的高效血管生成抑制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高效血管生成抑制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于，獲得編碼含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1基因，用于基因治療；或者進(jìn)行基因工程表達(dá)，分離、加工、純化、制備獲得含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高效血管生成抑制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于，獲得編碼含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5基因，用于基因治療；或者進(jìn)行基因工程表達(dá)，分離、加工、純化、制備獲得含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5。
全文摘要
本發(fā)明涉及高效血管生成抑制劑及其生產(chǎn)方法與應(yīng)用。本發(fā)明特點(diǎn)是1、本發(fā)明提出了具有整聯(lián)蛋白的親和性和結(jié)合能力的高效血管生成抑制劑，并給出了該高效血管生成抑制劑的一般結(jié)構(gòu)形式，以及含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1和含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5的具體結(jié)構(gòu)形式。2、本發(fā)明給出了高效血管生成抑制劑的一般生產(chǎn)方法，以及含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域1和含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纖溶酶原環(huán)柄結(jié)構(gòu)域5的具體生產(chǎn)方法。3、本發(fā)明指明了高效血管生成抑制劑在顯著提高現(xiàn)有的血管生成抑制劑抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和血管新生的活性和效率，降低現(xiàn)有血管生成抑制劑的使用劑量方面的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1478541SQ02138188
公開(kāi)日2004年3月3日 申請(qǐng)日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者華子春 申請(qǐng)人:華子春