專(zhuān)利名稱(chēng)：一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體生產(chǎn)狂犬疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，應(yīng)用于狂犬疫苗的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患疾病，人和所有的溫血?jiǎng)游飳?duì)狂犬病病毒都易感。一旦發(fā)病100%死亡，唯一有效的方法是接種有效的人用狂犬病疫苗。目前應(yīng)用的人用狂犬病疫苗有人二倍體細(xì)胞疫苗(HDCV)；原代地鼠腎細(xì)胞人用狂犬病疫苗(PHKCV)；精制雞胚細(xì)胞人用狂犬病疫苗(PCECV);Ver0細(xì)胞人用狂犬病疫苗(PVRV);鴨胚人用狂犬病疫苗 (PDEV)等。我國(guó)生產(chǎn)的人用狂犬病疫苗有PHKCV和PVRV兩種。目前我國(guó)批準(zhǔn)生產(chǎn)的滅活疫苗或減毒活疫苗除了乙肝疫苗外全部是用哺乳動(dòng)物細(xì)胞繁殖病毒方法制備的，哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)論對(duì)于病毒性疫苗和基因工程重組產(chǎn)品都是重要的細(xì)胞基質(zhì)，國(guó)際上早在80年代就開(kāi)始研制Vero細(xì)胞狂犬病疫苗和小兒麻痹疫苗Vero 細(xì)胞乙腦疫苗，腎綜合征出血熱疫苗和狂犬病疫苗在國(guó)內(nèi)已經(jīng)研制成功，Vero細(xì)胞SARS疫苗及Vero細(xì)胞脊髓灰質(zhì)炎疫苗的研究取得了較大進(jìn)展，這些疫苗的開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)證明我國(guó)哺乳動(dòng)物細(xì)胞疫苗的研制技術(shù)已日趨成熟，只是培養(yǎng)規(guī)模和設(shè)備比較落后，仍停留在轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞工廠培養(yǎng)的水平，歐美等西方發(fā)達(dá)國(guó)家主要是采用生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)病毒性疫苗，具有質(zhì)量好、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)過(guò)程中易于監(jiān)控重復(fù)性好，符合 GMP管理要求?！吨袊?guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告》一書(shū)指出細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)作為生物制藥中最為關(guān)鍵的技術(shù)已成為我國(guó)生物技術(shù)藥物產(chǎn)業(yè)化最難跨越的“門(mén)檻”。目彰常見(jiàn)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的種類(lèi) 氣升式(airlift)生物反應(yīng)器；
中空纖維管(hollow-fiber)生物反應(yīng)器； 流化床(fluidiz-bed)生物反應(yīng)器(FBR)； 攪拌罐(stir-tank)生物反應(yīng)器(STR)； 固定床(fixed-bed)生物反應(yīng)器； 填充床(packed-bed)生物反應(yīng)器。微載體是指直徑在60-250 μ m,能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自Van Wezel用DEAE-S^hadex A 50研制的第一種微載體問(wèn)世以來(lái)，國(guó)際市場(chǎng)上出售的微載體商品的類(lèi)型已經(jīng)達(dá)十幾種以上，包括液體微載體、 大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種CytodeXl、2、3，Cytopore和 Cytoline。微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類(lèi)型細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞。中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN102000326的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種生產(chǎn)人用狂犬病疫苗的方法，該專(zhuān)利所用的培養(yǎng)細(xì)胞為人二倍體細(xì)胞，人二倍體細(xì)胞由于受代次限制且細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，所以用于狂犬疫苗的生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，病毒收獲量較低。中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為 CN101716341A的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種人用二倍體細(xì)胞狂犬滅活疫苗及其制備方法，該專(zhuān)利所用細(xì)胞也為人二倍體細(xì)胞，狂犬病毒毒株為PM株。中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN1390604 的申請(qǐng)專(zhuān)利，公開(kāi)了大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)病毒疫苗的方法，該專(zhuān)利所用的生物反應(yīng)器為 CelligenPlus,規(guī)模僅為5. (Γ7. 5L，不適合于大規(guī)模的狂犬疫苗生產(chǎn)，且載體為聚酯切片 Fibra-Cel Disks。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體生產(chǎn)狂犬疫苗的方法，以解決目前狂犬疫苗生產(chǎn)中存在的生產(chǎn)周期較長(zhǎng)、病毒收獲量較低，不適合于大規(guī)模生產(chǎn)的問(wèn)題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是包括下列步驟
⑴在具有固定床籃式攪拌系統(tǒng)的Celligen 310型14L生物反應(yīng)器中，以BioNOC II cell culture disks為載體，培養(yǎng)Vero細(xì)胞，接種密度為0. 5 2X 106cells/ml ；
⑵在細(xì)胞生長(zhǎng)到5X IO7個(gè)/ml時(shí)，按1 :100 1 :500比例接種aGV或CTN-IV狂犬病毒，使病毒感染細(xì)胞；
⑶調(diào)節(jié)反應(yīng)器控制參數(shù)CO2壓為5% 10%、pH至7. 4 7. 8、溫度為30°C !35°C、溶氧20% 90%、葡萄糖濃度25 40uM、攪拌速率在20 lOOrpm，收獲病毒液； ⑷進(jìn)行病毒的濃縮、滅活、純化、凍干等步驟制成狂犬疫苗。目前由于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的提高，狂犬疫苗的生產(chǎn)都趨于應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行生產(chǎn)，以使各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。目前市場(chǎng)上生物反應(yīng)器和載體種類(lèi)繁多，其中以美國(guó)NBS 公司生產(chǎn)的生物反應(yīng)器質(zhì)量好、技術(shù)水平較高，應(yīng)用比較廣泛，相應(yīng)的使用美國(guó)NBS公司配套的聚酯切片F(xiàn)ibra-Cel Disks也較多，但本發(fā)明在大量的試驗(yàn)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用NBS 公司的CELLIGEN 310型14L生物反應(yīng)器搭配臺(tái)灣賽宇細(xì)胞科技股份有限公司的BioNOC II cell culture disks培養(yǎng)Vero細(xì)胞效果最好，細(xì)胞密度可達(dá)到5X 108/ml，病毒滴度可達(dá)IX 109FFU/ml，這個(gè)細(xì)胞密度和病毒滴度是在同等的培養(yǎng)條件下使用其他載體無(wú)法達(dá)到的，這一發(fā)現(xiàn)直接簡(jiǎn)化了后續(xù)的純化工作，解決了狂犬疫苗生產(chǎn)中的兩個(gè)技術(shù)難點(diǎn)疫苗效力和宿主細(xì)胞DNA殘留量。1、本發(fā)明應(yīng)用Vero細(xì)胞作為病毒培養(yǎng)用細(xì)胞。Vero細(xì)胞是廣譜宿主細(xì)胞，在國(guó)內(nèi)已經(jīng)由國(guó)家批準(zhǔn)作為疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于多種疫苗的生產(chǎn)，且生長(zhǎng)速度較人二倍體細(xì)胞快，更適合于應(yīng)用于大規(guī)模的疫苗生產(chǎn)；
2、本發(fā)明所用狂犬病毒毒株為aGV株或CTN-IV株。生產(chǎn)用疫苗株是生產(chǎn)出高質(zhì)量疫苗的關(guān)鍵，我國(guó)應(yīng)用的疫苗株主要為aG株(地鼠腎細(xì)胞的狂犬病疫苗)，CTN-IV株，兩個(gè)疫苗株均屬于基因I型，本發(fā)明適應(yīng)的aGV株同PV 株同源性為92%，同CVS比較，同源性為91%，同街毒株的比較為84%。本毒種采用小鼠腦腔攻擊毒力測(cè)定法測(cè)得毒力能夠達(dá)到8. 21gLD5(l/ml，這樣能夠保證制備出更高滴度的狂犬病毒用于疫苗的生產(chǎn)，為后續(xù)純化工作奠定基礎(chǔ)。3、本發(fā)明應(yīng)用美國(guó)NBS公司的CELLIGEN 310型14L細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器。CELLIGEN 310型14L細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器是目前世界上最先進(jìn)的動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其特點(diǎn)是適合貼壁培養(yǎng)細(xì)胞和懸浮細(xì)胞；適合各種動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和植物細(xì)胞等；灌流式的培養(yǎng)過(guò)程；低(無(wú))剪切力攪拌，無(wú)氣泡通氣；通過(guò)持續(xù)檢測(cè)攝氧率實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞濃度；其灌流式培養(yǎng)屬于連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中，收獲培養(yǎng)液的同時(shí)不斷加入新鮮培養(yǎng)基。灌流式培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是連續(xù)灌注的培養(yǎng)基可以提供充分的營(yíng)養(yǎng)成分， 并帶走代謝產(chǎn)物。同時(shí)，細(xì)胞保留在反應(yīng)器中，可以達(dá)到很高的細(xì)胞密度。同其他方法相比， 灌流式培養(yǎng)的病毒產(chǎn)率可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，并可以大大降低勞動(dòng)力的消耗。現(xiàn)有技術(shù)規(guī)模僅為5. (Γ7. 5L，單次病毒收獲液量較小，而本發(fā)明為14L，更適于生產(chǎn)。4、本發(fā)明應(yīng)用臺(tái)灣賽宇細(xì)胞科技股份有限公司的BioNOC II cell culture disks。BioNOC II cell culture disks適用于動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的生長(zhǎng)，其表面由 100%聚脂纖維素制成，為5 mm寬和10 mm長(zhǎng)的條形片狀載體，具有親水性三維多孔隙生長(zhǎng)表面，適合細(xì)胞生長(zhǎng)，一克BioNOC II cell culture disks能夠提供大約1. O χ IO9 個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的空間，也就是2，400 cm2/g。，該三維多孔隙生長(zhǎng)表面具提高提供細(xì)胞增生的表面積、增強(qiáng)細(xì)胞貼附能力等特性，能夠促進(jìn)細(xì)胞貼附、增強(qiáng)細(xì)胞增生和擴(kuò)散、細(xì)胞產(chǎn)量隨之增加。在本發(fā)明的應(yīng)用中Vero細(xì)胞密度可達(dá)5X IO8個(gè)/ml從而能夠制備高滴度的狂犬病毒。而目前應(yīng)用較多的的聚酯切片F(xiàn)ibra-Cel Disks，一克僅能提供3 χ IO5個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)空間，所能提供細(xì)胞生長(zhǎng)表面積為1，200cm2/g。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)的細(xì)胞密度高、病毒滴度和產(chǎn)量高以及生產(chǎn)成本低，此反應(yīng)器通過(guò)加入BioNOC II cell culture disks增加可供細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的表面積，再通過(guò)創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件使細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到5 X IO8個(gè)/ml，病毒滴度相應(yīng)的大幅度成對(duì)數(shù)增加，最高可達(dá)IXlO9FFU /ml，大幅度地降低了生產(chǎn)成本，適用于狂犬疫苗的大批量生產(chǎn)。


圖 1 為應(yīng)用 BioNOCII cell culture disks 與 NBS Fibra-Cel Disks 培養(yǎng)細(xì)胞增殖曲線比較。圖 2 為應(yīng)用 BioNOCII cell culture disks 與 NBS Fibra-Cel Disks 培養(yǎng)病毒滴度比較。
具體實(shí)施例方式細(xì)胞非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞；
毒種aGV (毒力大于 7. 51gLD50/ml)或 CTN-IV 株； 復(fù)蘇工作種子批Vero細(xì)胞，用3L轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行傳代、擴(kuò)增； 具有固定床籃式攪拌系統(tǒng)的Celligen 310型14L生物反應(yīng)器； 以 BioNOC II cell culture disks 為載體。實(shí)施例1
(1)將具有固定床籃式攪拌系統(tǒng)的Celligen 310型14L生物反應(yīng)器滅菌后組裝完備， 加入細(xì)胞培養(yǎng)液，加入BioNOC II cell culture disks微載體15g/L，培養(yǎng)液中小牛血清含量5%、調(diào)節(jié)PH至7. 0、溫度33°C、攪拌速度速度20rpm過(guò)夜；接種經(jīng)3L轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增的Vero 細(xì)胞，接種密度為0. 5 X 106cellS/ml，調(diào)節(jié)CO2壓為5%、pH至7. 2，溫度為35°C、溶氧20%、葡萄糖濃度25uM、攪拌速率在20rpm ；
(2)當(dāng)細(xì)胞密度增至5X107cellS/ml接種aGV病毒，接種比例為1:100，
(3)通過(guò)生化分析儀檢測(cè)葡萄糖和乳酸含量等參數(shù)，調(diào)節(jié)反應(yīng)器控制參數(shù)C02壓為 5%、pH至7. 4，溫度為30°C、溶氧20%、葡萄糖濃度25uM、攪拌速率在20rpm ；每間隔M小時(shí)取樣測(cè)定病毒毒力及抗原含量，以此進(jìn)行病毒收獲，當(dāng)測(cè)得毒力高于IX 107FFU/ml時(shí)開(kāi)始收獲單次病毒液，收獲期持續(xù)15天，其中5天病毒毒力持續(xù)在IX 108FFU/ml，毒力下降至 1 X 106FFU/ml時(shí)停止收獲；
(4 )收獲病毒液進(jìn)行合并、超濾濃縮、滅活、純化、凍干、分裝成狂犬疫苗成品。實(shí)施例2
(1)將具有固定床籃式攪拌系統(tǒng)的Celligen310型14L生物反應(yīng)器滅菌后組裝完備， 加入細(xì)胞培養(yǎng)液，加入BioNOC II cell culture disks微載體18g/L，培養(yǎng)液中小牛血清含量8%、調(diào)節(jié)PH至7. 2、溫度35°C、攪拌速度速度35rpm過(guò)夜；接種經(jīng)3L轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增的Vero 細(xì)胞，接種密度為1. 3X 106cellS/ml，調(diào)節(jié)CO2壓為8%、pH至7. 3，溫度為36°C、溶氧55%、葡萄糖濃度35uM、攪拌速率在60rpm ；
(2)當(dāng)細(xì)胞密度增至5X107cellS/ml接種aGV病毒，接種比例為1:300，
(3)通過(guò)生化分析儀檢測(cè)葡萄糖和乳酸含量等參數(shù)，調(diào)節(jié)反應(yīng)器控制參數(shù)C02壓為8%、 PH至7. 6，溫度為33°C、溶氧55%、葡萄糖濃度35uM、攪拌速率在60rpm ；每間隔M小時(shí)取樣測(cè)定病毒毒力及抗原含量，以此進(jìn)行病毒收獲，當(dāng)測(cè)得毒力高于IX 107FFU/ml時(shí)開(kāi)始收獲單次病毒液，收獲期持續(xù)15 20天，其中5 10天病毒毒力持續(xù)在1 X IO8 1 X IO9FFU/ ml，毒力下降至lX106FFU/ml時(shí)停止收獲；
(4 )收獲病毒液進(jìn)行合并、超濾濃縮、滅活、純化、凍干、分裝成狂犬疫苗成品。實(shí)施例3
(1)將具有固定床籃式攪拌系統(tǒng)的Celligen310型14L生物反應(yīng)器滅菌后組裝完備， 加入細(xì)胞培養(yǎng)液，加入BioNOC II cell culture disks微載體20g/L，培養(yǎng)液中小牛血清含量10%、調(diào)節(jié)PH至7. 4、溫度37°C、攪拌速度速度50rpm過(guò)夜；接種經(jīng)3L轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增的Vero 細(xì)胞，接種密度為2X106cellS/ml，調(diào)節(jié)CO2壓為10%、pH至7. 4，溫度為37°C、溶氧90%、葡萄糖濃度40uM、攪拌速率在IOOrpm ；
(2)當(dāng)細(xì)胞密度增至5X107cellS/ml接種aGV病毒，接種比例為1:500，
(3)通過(guò)生化分析儀檢測(cè)葡萄糖和乳酸含量等參數(shù)，調(diào)節(jié)反應(yīng)器控制參數(shù)C02壓為 10%、pH至7. 8，溫度為35°C、溶氧90%、葡萄糖濃度40uM、攪拌速率在IOOrpm ；每間隔M 小時(shí)取樣測(cè)定病毒毒力及抗原含量，以此進(jìn)行病毒收獲，當(dāng)測(cè)得毒力高于IX 107FFU/ml時(shí)開(kāi)始收獲單次病毒液，收獲期持續(xù)15 20天，其中5 10天病毒毒力持續(xù)在1 X IO8 lX109FFU/ml，毒力下降至lX106FFU/ml時(shí)停止收獲；
(4 )收獲病毒液進(jìn)行合并、超濾濃縮、滅活、純化、凍干、分裝成狂犬疫苗成品。實(shí)施例4 6
將實(shí)施例廣3中步驟(2)中接種CTN-IV病毒株。對(duì)比實(shí)驗(yàn)例(1)準(zhǔn)備兩臺(tái)Celligen 310型14L生物反應(yīng)器，滅菌后組裝完備，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入 BioNOC II cell culture disks 和 NBS Fibra-Cel Disks 微載體 20g/L，兩臺(tái)生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件相同，均為培養(yǎng)液中小牛血清含量10%、調(diào)節(jié)pH至7. 4、溫度37°C、攪拌速度速度50rpm過(guò)夜；接種經(jīng)3L轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增的Vero細(xì)胞，接種密度為2X 106cells/ml，調(diào)節(jié) CO2壓為10%、pH至7. 4，溫度為37°C、溶氧90%、葡萄糖濃度40uM、攪拌速率在IOOrpm ；每間隔M小時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞密度。(2)當(dāng)兩個(gè)反應(yīng)器細(xì)胞密度增至5X107cellS/ml時(shí)接種aGV病毒，接種比例為1 200。(3)調(diào)節(jié)兩反應(yīng)器控制參數(shù)，使反應(yīng)條件一致C02壓為10%、pH至7. 8，溫度為 35°C、溶氧90%、葡萄糖濃度40uM、攪拌速率在lOOrpm。每間隔M小時(shí)取樣測(cè)定病毒毒力；
對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖 1 為應(yīng)用 BioNOC II cell culture disks 與 NBS Fibra-Cel Disks 培養(yǎng)細(xì)胞增殖曲線比較。圖中所示橫坐標(biāo)為細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞密度。應(yīng)用上述兩種載體培養(yǎng)的起始細(xì)胞密度均為2. OXlOfVml，應(yīng)用BioNOC II cell culture disks培養(yǎng)的細(xì)胞從第 8天開(kāi)始就已經(jīng)達(dá)到1. OX 108/ml，細(xì)胞密度持續(xù)升高，第10天到第20天細(xì)胞密度持續(xù)在 4. OX 108 5. OX lOVml之間，且最高可達(dá)5. OX 108/ml，第19天開(kāi)始有下降趨勢(shì)；而應(yīng)用NBS Fibra-Cel Disks培養(yǎng)的細(xì)胞從第9天開(kāi)始達(dá)到1. OX 108/ml，但細(xì)胞密度增長(zhǎng)緩慢，第11 天到第20天細(xì)胞密度持續(xù)在2. OX 108、. OX 108/ml之間，且最高只達(dá)到4. OX 108/ml。圖 2 為應(yīng)用 BioNOC II cell culture disks 與 NBS Fibra-Cel Disks 培養(yǎng)病毒滴度比較。圖中所示橫坐標(biāo)為病毒培養(yǎng)天數(shù)，縱坐標(biāo)為病毒滴度，病毒滴度采用免疫熒光法檢測(cè)。應(yīng)用上述兩種載體培養(yǎng)的起始病毒滴度均為6.0 X 106FFU/ml，應(yīng)用BioNOC II cell culture disks培養(yǎng)的病毒滴度從第10天開(kāi)始就已經(jīng)達(dá)到2. OX 108FFU/ml，且病毒滴度持續(xù)升高，到第13天達(dá)到最高1. lX109FFU/ml，之后陸續(xù)下降，到第17天病毒滴度降至 107FFU/ml ；而應(yīng)用NBS Fibra-Cel Disks培養(yǎng)的病毒滴度從第12天開(kāi)始達(dá)到2. OX IO8FFU/ ml，到第14天達(dá)到最高6.0X108FFU/ml，之后陸續(xù)下降，到第17天病毒滴度降至IO7FFU/ ml ο對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)論
以上兩組對(duì)比試驗(yàn)說(shuō)明應(yīng)用BioNOC II cell culture disks比應(yīng)用NBS Fibra-Cel Disks培養(yǎng)的細(xì)胞密度和病毒毒力都要高很多，且細(xì)胞高密度和病毒高滴度的持續(xù)時(shí)間均較長(zhǎng)。所以應(yīng)用 BioNOC II cell culture disks 比應(yīng)用 NBS Fibra-Cel Disks 更適合于 NBS的Celligen 310型14L生物反應(yīng)器進(jìn)行狂犬疫苗的生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體生產(chǎn)狂犬疫苗的方法，其特征在于包括下列步驟 ⑴在具有固定床籃式攪拌系統(tǒng)的Celligen 310型14L生物反應(yīng)器中，以BioNOC II cell culture disks為載體，培養(yǎng)Vero細(xì)胞，接種密度為0. 5 2X 106cells/ml ；⑵在細(xì)胞生長(zhǎng)到5X IO7個(gè)/ml時(shí)，按1 :100 1 :500比例接種aGV或CTN-IV狂犬病毒，使病毒感染細(xì)胞；⑶調(diào)節(jié)反應(yīng)器控制參數(shù)CO2壓為5% 10%、pH至7. 4 7. 8、溫度為30°C !35°C、溶氧20% 90%、葡萄糖濃度25 40uM、攪拌速率在20 lOOrpm，收獲病毒液； ⑷進(jìn)行病毒的濃縮、滅活、純化、凍干等步驟制成狂犬疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體生產(chǎn)狂犬疫苗的方法，其特征在于步驟⑴中加入BioNOC II cell culture disks微載體為15 20g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體生產(chǎn)狂犬疫苗的方法，其特征在于步驟⑴調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器參數(shù)C02壓為5% 10%、pH至7. 2 7. 4，溫度為 37°C、 溶氧20% 90%、葡萄糖濃度25 40uM、攪拌速率在20 lOOrpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體生產(chǎn)狂犬疫苗的方法，其特征在于步驟⑶收獲病毒液方法當(dāng)測(cè)得毒力高于lX107FFU/ml時(shí)開(kāi)始收獲單次病毒液，收獲期持續(xù)15 20天，其中5 10天病毒毒力持續(xù)在IX IO8 1 X 109FFU/ml，毒力下降至 1 X 106FFU/ml時(shí)停止收獲。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體生產(chǎn)狂犬疫苗的方法，屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域。在具有固定床籃式攪拌系統(tǒng)的Celligen310型14L生物反應(yīng)器中以臺(tái)灣賽宇細(xì)胞科技股份有限公司的BioNOCII cellculturedisks為載體培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)特定的上罐細(xì)胞密度、所加病毒和生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)制備高滴度的狂犬病毒，生產(chǎn)狂犬疫苗。該方法具有培養(yǎng)的細(xì)胞密度高、病毒滴度和產(chǎn)量高以及生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，此反應(yīng)器通過(guò)加入BioNOCII cellculturedisks增加可供細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的表面積，再通過(guò)創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件使細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到5×108個(gè)/ml，病毒滴度相應(yīng)的大幅度成對(duì)數(shù)增加，最高可達(dá)1×109FFU/ml，大幅度地降低了生產(chǎn)成本，適用于狂犬疫苗的大批量生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102240400SQ201110137119
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者丁麗麗, 井偉東, 劉巖, 姜文波, 崔文廣, 李宇輝, 楊屹, 苑志剛, 苗麗, 蔡月紅, 郭秀俠 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春生物制品研究所