專利名稱：一種長效生長激素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物。具體為雙端活化的聚乙二醇修飾生長激素。
背景技術(shù)：
人生長激素(hGH)是二十世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)的由人垂體前葉嗜酸細(xì)胞分泌的重要激素，是由191個氨基酸殘基組成的單鏈、非糖化親水性蛋白，在第53-165和第182-189氨基酸之間各有一個二硫鍵連接，相對分子質(zhì)量約為21700道爾頓，pI4. 9-5. 2。用糜蛋白酶或胰蛋白酶處理生長激素使其部分水解，活性并不喪失，可見生長激素的活性并不需要整個分子。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人生長激素N-端的1 134氨基酸段肽鏈為活性所必需，C-端的一段肽鏈可能起保護(hù)作用，使生長激素在血循環(huán)中不致被酶破壞。人生長激素分子相當(dāng)穩(wěn)定，其活性在冰凍條件下可保持?jǐn)?shù)年，在室溫放置4 無變化。不同種屬的哺乳動物的生長激素之間有明顯的種屬特異性，只有靈長類的生長激素對人有活性。hGH的作用機(jī)理一般認(rèn)為是通過cAMP進(jìn)行的，在與靶細(xì)胞結(jié)合后能改變氨基酸及代謝產(chǎn)物的運(yùn)轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)某些特異性蛋白質(zhì)和核酸的合成。1、人生長激素的促生長作用人生長激素最明顯的作用是促進(jìn)骨、軟骨和組織的生長。它能刺激蛋白質(zhì)和膠原的合成，促進(jìn)組織對循環(huán)系統(tǒng)中氨基酸的攝取和利用。人在幼年與成年時hGH的水平并無多大的差異(血清或血漿中檢測的常規(guī)參考值為成年男性< 2μ g/L ；成年女性< 10 μ g/ L ；兒童< 20 μ g/L)，但在人生長發(fā)育的幼年期時，機(jī)體組織對hGH更為敏感，hGH對骨的促生長作用取決于骺軟骨在成長中的狀況。人在幼年和育成期時GH對四肢長骨生長有促進(jìn)作用，故出生后至性成熟期先是身高增長加快，隨后主要促進(jìn)軀干和脊柱的生長；此時體長的生長較為迅速，至成年時四肢和脊柱的生長已基本結(jié)束。hGH對維持骨的延長雖屬必要， 但并非起直接作用。它是通過血中SM或稱硫酸化因子(Sulfationfactor)來實(shí)現(xiàn)。這是一種肽類激素，分子量4000Da，能促進(jìn)S042_、H-胸苷、H-尿苷和C-亮氨酸進(jìn)入軟骨，增加膠原組織和蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞、肝、肌肉和纖維母細(xì)胞的分裂。SM-C及其運(yùn)載蛋白的含量受hGH調(diào)控。2、hGH促進(jìn)蛋白質(zhì)合成hGH能促進(jìn)氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，加速蛋白質(zhì)的合成，減少尿素、肌酸和氮的排出，促使體內(nèi)保持氮的動態(tài)平衡。在蛋白質(zhì)的合成過程中，hGH可加強(qiáng)tRNA合成，促進(jìn)氨基酸的攝取，嘌呤霉素不能阻斷此效應(yīng)，提示hGH不是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)形成某種新蛋白質(zhì)而是加強(qiáng)氨基酸的運(yùn)轉(zhuǎn)。胰島素能促進(jìn)氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，但要在hGH存在時有此效應(yīng)。3、hGH對脂肪和糖代謝的影響hGH能促使動物的脂肪分解，抑制葡萄糖氧化，減少葡萄糖的消耗、hGH對糖代謝作用較復(fù)雜。生理水平的hGH可刺激胰島素B細(xì)胞，引起胰島素分泌，加強(qiáng)葡萄糖的利用， 過量的hGH則抑制葡萄糖的利用。
人生長激素提取并試用于兒童侏儒癥始于1958年。后經(jīng)不斷改進(jìn)產(chǎn)品純度和進(jìn)行臨床試驗(yàn)，在確認(rèn)臨床有效后自1975年起逐步在各國正式獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用。由于提取的人生長激素來于死人腦垂體，臨床用量難以保證，因此人們開始嘗試用化學(xué)合成和基因重組方法生產(chǎn)人生長激素。其中前法效率甚低，無實(shí)用價值。后法卻在美國Genentech公司等的努力下于1981年實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化。Genentech公司生產(chǎn)的基因重組人生長激素商品名為Somatrem，在臨床試驗(yàn)中被證明與提取的人生長激素生理活性完全相同。美國Li 1 Iy公司和丹麥Novo Nordisk公司等也相繼開發(fā)成功了重組人生長激素。人生長激素的工業(yè)化生產(chǎn)現(xiàn)均已采用基因重組技術(shù)， 其一般方法是化學(xué)合成人生長激素的DNA片段，再用分子克隆技術(shù)擴(kuò)增、克隆，獲得人生長激素的完整基因，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵及后處理即得到目的蛋白純品。但溶解度低、穩(wěn)定性差、半衰期短、存在免疫原性等缺陷限制其給藥途徑和藥效的發(fā)揮。目前PEG修飾技術(shù)日趨成熟，修飾后的蛋白其溶解性和穩(wěn)定性增加，耐酶水解的能力增強(qiáng)，免疫原性減弱甚至消除，半衰期延長，增加藥物的治療指數(shù)，擴(kuò)大臨床使用，生物利用度提高，毒副作用減小，熱穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性增加。基于此，利用我公司比較成熟的PEG 修飾技術(shù)平臺對重組人生長激素進(jìn)行修飾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種聚乙二醇修飾的雙價重組人生長激素，該修飾產(chǎn)物不僅延長了重組人生激素的半衰期，提高了穩(wěn)定性，降低了免疫原性，而且降低了該藥物的給藥次數(shù)和給藥劑量，一次給藥比需每天注射多次給藥具有高強(qiáng)的促進(jìn)動物機(jī)體生長的生物活性和長效的藥理作用。本發(fā)明通過對PEG雙端活化，形成一種新的修飾劑ALD-PEG-ALD，方法參考文 獻(xiàn) J. MiltonHarris, Evelyn C.Struck. Synthesis and Characterrization of Poly (ethylene Glycol) Derivatives，采用該新型修飾劑對重組人生長激素進(jìn)行修飾，獲得一種雙價蛋白質(zhì)修飾藥物GH-PEG-GH，其活性是GH的1. 7倍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1雙端活化聚乙二醇獲得ALD-PEG-ALD以分子量為20000道爾頓藥用級聚乙二醇為底物，加入草酰氯，DMSO在-60°C 到-70°C反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用三乙胺淬滅，二氯甲烷萃取，飽和的氯化鈉洗，濃縮至干，加乙醚析出固體抽濾干燥生成雙端活化的聚乙二醇ALD-PEG-ALD。實(shí)施例2重組人生長激素的純化配制20mM ρΗ8· OTris-HCl,緩沖液Α,按菌體抽提緩沖液(g/ml)為1 20超聲破碎，超聲按工作Is間歇Is全程時間40min，1200-1600W，30°C過熱保護(hù)，破碎后按 4900rpm*35min離心，收集沉淀，洗滌包涵體。將包涵體溶于8M尿素，20mM Tris-HCl中，PH9. 0，在室溫下攪拌變性1小時，離心去除不溶物，上清用4倍體積的10%甘油，20mMTris-HCl PH8. 0稀釋，4°C過夜，用Q柱純化， GH單體和二聚體可用250mM NaCl洗脫，進(jìn)一步用S-200可將二聚體和單體分離，單體可用于修飾反應(yīng)。
實(shí)施例3修飾反應(yīng)GH純品濃度調(diào)節(jié)至5.0mg/ml，加入20mM氫硼氰化鈉，充分溶解，按摩爾比 GH ALD-PEG-ALD = 1 1，1 5，1 10加入 ALD-PEG_ALD，4°C反應(yīng)4hr，以確定兩種試劑的最佳比例。用非還原電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要為雙修飾產(chǎn)物，掃描分析修飾率達(dá)到30%。 利用S-300分子篩層析將修飾物GH-PEG-GH與其他多修飾分子及未修飾的GH分離，目標(biāo)物質(zhì)可用非還原電泳檢測，分離后純品凍干保存。實(shí)施例4全身過敏反應(yīng)檢驗(yàn)豚鼠60只，雌雄各半，體重250_300g，均分為三組，將GH與GH-PEG-GH按人用劑量的三倍腹腔給藥，隔日一次，給藥三次，使其致敏，將GH與GH-PEG-GH按人用劑量的六倍與致敏后的第14天，21天分別于豚鼠小腿脛靜脈注射激發(fā)，30min內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。表1豚鼠全身過敏試驗(yàn)級數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇修飾的生長激素，其特征在于該聚乙二醇化生長激素是以聚乙二醇為連接物的兩個生長激素分子的串聯(lián)體。
2.權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的生長激素，其特征在于生長激素可以來源于動物，也可以是基因重組人源生長激素，優(yōu)選基因重組人源生長激素。
3.權(quán)利要求1-2所述的聚乙二醇修飾的生長激素，其特征在于所用的聚乙二醇雙端均經(jīng)過活化，并且都能與生長激素共價交聯(lián)。
4.權(quán)利要求1-3所述的聚乙二醇修飾的生長激素，其特征在于聚乙二醇兩端被活化成醛或酮結(jié)構(gòu)，優(yōu)選為醛結(jié)構(gòu)。
5.權(quán)利要求1-4所述的聚乙二醇修飾的生長激素，其特征在于所用聚乙二醇分子量從200-200000道爾頓，優(yōu)選2000-10000道爾頓，更優(yōu)選為2000道爾頓。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚乙二醇修飾的雙價生長激素，旨在提供一種免疫原性低、活性高、半衰期長、給藥次數(shù)少、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物，主要用于治療生長遲緩性疾病。其中的聚乙二醇雙端活化，通過與蛋白質(zhì)的游離氨基連接將兩個生長激素分子連接成一個雙價的柔性分子。
文檔編號A61P43/00GK102190721SQ201010117330
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者吳彥卓, 徐明波, 楊仲璠, 王俊玲 申請人:北京雙鷺立生醫(yī)藥科技有限公司, 北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司