專(zhuān)利名稱：乙型肝炎核酸疫苗及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的抗HBV病毒的DNA疫苗及其構(gòu)
建方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性的傳染病。我國(guó)是HBV感染 高發(fā)區(qū)，約有7-8億人感染過(guò)乙型肝炎，約1.2億人為乙肝病毒攜帶者，他們中的1/4發(fā)展 為慢性肝炎、肝硬化或原發(fā)性肝癌。自1985年我過(guò)開(kāi)始接種乙肝疫苗以來(lái)，在免疫兒童中 乙肝病毒攜帶者已由10%降至左右。因此實(shí)踐證明，乙肝疫苗是預(yù)防和控制乙型肝炎 最有效的武器。乙型肝炎病毒為嗜肝DNA病毒，具有雙層殼結(jié)構(gòu)，外殼由乙型肝炎病毒表面抗 原(HBsAg)、前Sl蛋白(preSl)、前S2蛋白(preS2)構(gòu)成；內(nèi)殼由乙型肝炎病毒核心抗原 (HBcAg)和e抗原(HBeAg)構(gòu)成；內(nèi)殼內(nèi)有雙鏈環(huán)狀DNA和DNA聚合酶。目前有報(bào)道的乙肝病毒疫苗主要包含HBsAg、preSl、preS2和HBcAg任意一種或者 幾種基因，再加上一些具有免疫增強(qiáng)作用的細(xì)胞因子基因，或者淋巴細(xì)胞表位基因等(Qing Y, et al. Construction of an HBV DNA vaccine byfusion of the GM-CSF gene to the HBV-S gene and examination of its immuneeffects in normal and HBV-transgenic mice. Vaccine. 2010Junll ；28 (26) :4301_7.)。但是其免疫預(yù)防效果和治療效果一直不盡 人意，尤其是對(duì)慢性HBV感染者來(lái)說(shuō)，由于體內(nèi)長(zhǎng)期存在相應(yīng)抗原，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)于HBV 抗原已經(jīng)形成免疫耐受狀態(tài)，因此其接種該疫苗后，免疫反應(yīng)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常人。因此乙肝 DNA疫苗對(duì)于慢性乙肝患者的免疫耐受和激活HBV特異性T細(xì)胞免疫的效果不是很理想。microRNA作為近年來(lái)生物學(xué)研究的熱門(mén)分子受到廣泛的關(guān)注。microRNA參與了 生物體眾多轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程，在細(xì)胞增殖分化、抗腫瘤與免疫等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。有研究 表明，microRNA參與了人體許多免疫通路的調(diào)控，細(xì)胞免疫與體液免疫等領(lǐng)域都發(fā)揮重要 作用。miRNA-lSla能夠調(diào)節(jié)B細(xì)胞分化，并能夠調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞活化與敏感性，因此可以 作為天然的疫苗佐劑力口 以利用(Mark A. Lindsay. microRNAs and the immune response. Trends inlmmunology, Volume 29,Issue 7,343-351)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠同時(shí)激活機(jī)體體液免疫與細(xì)胞免疫，免疫效果 強(qiáng)，免疫作用持久，構(gòu)建工藝簡(jiǎn)便的抗HBV病毒DNA疫苗。如背景技術(shù)所述，現(xiàn)有的乙肝核酸疫苗存在諸多缺陷，因此如果能夠在傳統(tǒng)核酸 疫苗后直接連接疫苗佐劑便可提高其免疫效果。基于以上理論，本發(fā)明人用分子生物學(xué)技 術(shù)手段，將HBV病毒的表面抗原、核心抗原與e抗原基因克隆入真核表達(dá)載體，并在其后加 入miRNAlSla前體片段作為增強(qiáng)免疫效果的疫苗佐劑，從而構(gòu)建一種既含有抗原蛋白基因 又含有疫苗佐劑的新型乙肝DNA疫苗。
本發(fā)明提供了一種乙型肝炎核酸疫苗，以真核表達(dá)載體為基本骨架，含有乙肝病 毒HBV包膜蛋白基因HBsAg、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因；還含有人的pre-miR181a 序列，其中乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示、乙肝病毒 核心抗原HBc與e抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；人的pre_miR181a序列如 SEQ ID NO 5 所示。所述的真核表達(dá)載體為Invitrogen公司的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA 3. l/V5_His B。本發(fā)明還提供了上述乙肝核酸疫苗的構(gòu)建方法，包含以下步驟A、乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因以及人 miR181a前體基因克隆(I)以HBV全基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到HBV SDNA片段，引 物序列如下S-F :ATGGAGAGCACAACATCAGGS-F TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGA(II)以HBV全基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到HBV C抗原與e抗 原的DNA序列，引物序列如下C-F :ATGGACATTGACCCGTATAAC-F CTAACATTGAGATTCCCGAGAT(III)以THP-I細(xì)胞基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到miR181a前 體，引物序列如下181F TCGACTTGAAACCCAGAGAGG18IR :AATTCACTGGACCACATTTGGB、將上述乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因以及 人miR181a前體基因插入同一真核表達(dá)載體pcDNA 3. l/V5_His B。本發(fā)明還提供了上述乙肝核酸疫苗在用于制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的乙肝核酸疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)第一，本疫苗通過(guò)真核表達(dá)質(zhì)粒介導(dǎo)注射 方式接種，安全可靠；第二，本疫苗能夠同時(shí)作用機(jī)體體液免疫與細(xì)胞免疫，免疫效果較好； 第三，由于本疫苗克隆表達(dá)HBV病毒完整的表面抗原、核心抗原與e抗原，所以其免疫效果 與對(duì)機(jī)體的保護(hù)力明顯高于多表位疫苗；第四，本疫苗以真核表達(dá)質(zhì)粒為載體，能夠在體內(nèi) 長(zhǎng)期表達(dá)，免疫效果持久；第五，本疫苗自身已包括microRNA佐劑，不需額外添加，簡(jiǎn)化制 作工藝。


圖1為本核酸疫苗pcDNA3. l_S-C_181a結(jié)構(gòu)示意2為HBV S抗原真核表達(dá)載體制備流程3為HBV核心抗原與e抗原真核表達(dá)載體制備流程4為pre-miR181a表達(dá)載體制備流程5為ELISP0T法測(cè)定在HBsAg與HBc刺激后本核酸疫苗對(duì)于小鼠脾臟細(xì)胞免疫 激活情況，其中圖5a縱坐標(biāo)表示每IO6脾臟中產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞數(shù)目，橫坐標(biāo)表示組別； 圖5b縱坐標(biāo)表示每IO6脾臟中產(chǎn)生IL-4的細(xì)胞數(shù)目，橫坐標(biāo)表示組別。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1 本發(fā)明核酸疫苗的構(gòu)建本發(fā)明所采用PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建DNA疫苗，可 以參考美國(guó)薩姆布魯克著《分子克隆》第二版。PCR引物設(shè)計(jì)軟件為Premier Biosoft International ^w] ^ Primer PREMER V。構(gòu)建本疫苗的基本材料包括人單核細(xì)胞THP-I (購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))、穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染HBV全病毒的H印G 2. 215肝癌細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒所)；真核表達(dá)載體 pcDNA 3. 1/V5-His B 質(zhì)粒(購(gòu)自 Invitrogen 公司)。構(gòu)建本核算病毒所需試劑包括Prime Star高保真DNA聚合酶(購(gòu)自TaKaRa公 司)、pMD18T克隆載體(購(gòu)自TaKaRa公司)、各種限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自NEB公司)、T4連接 酶(購(gòu)自TaKaRa公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑M-MLV (購(gòu)自Invitrogen公司)、RNA抽提Trizol試 劑(購(gòu)自Invitrogen公司)。構(gòu)建本疫苗的基本步驟包括(I)HBV S抗原表達(dá)載體制備如圖2所示，以HBV全基因組為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到HBV S DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。引物序列為S-F :ATGGAGAGCACAACATCAGGS-F TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGAPCR反應(yīng)體系為ddH2036 μ 1IOXPrime Star Buffer5μ 1dNTPs4 μ 1S-F1 μ 1S-R1 μ 1HBV 基因組1·5μ1Prime Star 酶1. 5μ 1_50 μ 1PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min -MV -30s, 55°C -30s, 72°C -lmin，30 個(gè)循環(huán)； 72°C后延伸7min ；4°C保存。將HBV S PCR產(chǎn)物通過(guò)1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，得到HBVS DNA片 段。將該片段連接入克隆載體PMD18T，連接體系為HBV S DNA18 μ 1pMD18T1 μ 1Solution I1 μ 1
_20 μ 116°C連接過(guò)夜后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入ToplOCaCl2感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)挑克隆，委托 Invitrogen公司測(cè)序。待確定測(cè)序結(jié)果正確后，確定得到HBV S抗原克隆載體T-S，并保存 該菌種。將T-S質(zhì)粒與真核表達(dá)載體pcDNA 3. l/V5_His B用Kpn I與BamH I限制性內(nèi)切 酶消化，分別回收消化后的HBV S DNA片段與載體pcDNA 3. 1/V5-His B。酶切體系為ddH2049 μ 1T-S/pcDNA 3. 140 μ 1IOXK Buffer5μ 1KpnI3 μ 1BamHI3 μ 1_100 μ 1Τ4連接酶16°C連接片段與載體過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入ToplOCaCl2 胞，挑取單克隆菌落并進(jìn)行菌落PCR鑒定與酶切鑒定。鑒定成功后保存菌落， pcDNA3. I-S。(2) HBV C抗原與e抗原表達(dá)載體制備如圖3所示，以HBV全基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)得到HBV e抗原的DNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。引物序列為C-F :ATGGACATTGACCCGTATAAC-F CTAACATTGAGATTCCCGAGATPCR反應(yīng)體系參照HBV S DNA片段制備。PCR反應(yīng)條件為94 °C預(yù)變性5min ； 940C -30s, 530C -30s, 72°C _lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C后延伸 7min ；4°C保存。將HBV C抗原與e抗原的PCR產(chǎn)物膠回收后連接入pMD18T，連接體系及條件與HBV S抗原相同。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后經(jīng)挑克隆，委托Irwitrogen公司測(cè)序，并將測(cè)序正確的克隆保 菌并命名為T(mén)-C。用EcoR I與Xba I限制性內(nèi)切酶酶切T-C質(zhì)粒與HBV S抗原表達(dá)載體pcDNA3. 1_S 以及空載體pcDNA 3. 1/V5-His B。酶切體系為ddH2044 μ 1T-C/pcDNA3. l_S/pcDNA3. 140 μ 1IOXM Buffer10 μ 1EcoRI3 μ 1XbaI3 μ 1_100 μ 1 37°C酶切過(guò)夜，用的瓊脂糖膠回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶16°C連接片段與載體 過(guò)夜。將連接好的片段與載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，之后挑克隆并進(jìn)行菌落PCR鑒定與酶切
感受態(tài)細(xì) 并命名為
C抗原與鑒定，鑒定正確后保菌并分別命名為pcDNA3. I-S-C與pcDNA3. I-C0(3)miR181a前體疫苗佐劑表達(dá)載體構(gòu)建如圖 4 所示，通過(guò)在 Sanger miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org)上檢索， 我們得到人的miRlSla的前體序列，如SEQ ID NO :3所示。將該序列進(jìn)行人類(lèi)基因組BLAST， 對(duì)其所在基因座位進(jìn)行定位，并向其兩側(cè)翼延伸大約200bp得到一段DNA序列，如SEQ ID NO 4所示，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性引物181F TCGACTTGAAACCCAGAGAGG18IR :AATTCACTGGACCACATTTGG參照美國(guó)薩姆布魯克著《分子克隆》第二版，通過(guò)酚氯仿法提取THP-I細(xì)胞基因 組，并以此基因組為模板通過(guò)PCR反應(yīng)得到miRlSla前體。PCR反應(yīng)體系與條件如下
0088]ddH2036 μ 1
0089]IOXPrime Star Buffer5μ 1
0090]dNTPs4 μ 1
0091]181F1 μ 1
0092]181R1 μ 1
0093]THP-I細(xì)胞基因組1· 5 μ 1
0094]Prime Star 酶1· 5 μ 1
0095]_
0096]50 μ 1PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min -MV -30s, 59°C -30s, 72°C -lmin，30 個(gè)循環(huán)； 72°C后延伸7min ；4°C保存。將miRlSla的PCR產(chǎn)物連接入pMD18T載體，連接體系與條件如前所述。將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化后委托Irwitrogen公司測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的保菌，并命名為T(mén)-181a。用Hind III與Kpn I雙酶切T_181a與pcDNA3. I-S-C質(zhì)粒，酶切體系如下
0100]ddH2044 μ 1
0101]T_181a/pcDNA3. I-S-C40 μ 1
0102]IOXM Buffer10 μ 1
0103]Hind III3μ 1
0104]Kpn I3μ 1
0105]_
0106]100 μ 1酶切反應(yīng)條件為37°C，4小時(shí)。將酶切產(chǎn)物回收后通過(guò)T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化。經(jīng) 挑克隆，菌落PCR與酶切鑒定后，將鑒定正確的菌落保菌，命名為pcDNA3. l-S-C-181a。實(shí)施例2 本發(fā)明核酸疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證本發(fā)明對(duì)于HBV感染的保護(hù)效力，本發(fā)明比較了 pcDNA3. 1-S-C_181a、表 達(dá)HBV S抗原的pcDNA3. 1-S、表達(dá)HBV C抗原與e抗原的pcDNA3. 1_C對(duì)于小鼠免疫效果的差別。實(shí)驗(yàn)用小鼠為雌性8周齡Balb/C小鼠，30只，共分為3組，每組10只。其中一組 注射pcDNA3. l-S-C-181a，二組注射pcDNA3. 1-S，三組注射pcDNA3. 1-C，注射方式為肌肉注射，按0. Img/只小鼠的注射量實(shí)施。為了增強(qiáng)免疫效果，注射后再以注射孔為中心，將電脈 沖電擊垂直插入，電極針插入略深于注射深度，電場(chǎng)強(qiáng)度為200v/cm，放電6次，10秒后拔出 電極針。共進(jìn)行3次免疫，每次免疫間隔2周。每次免疫前斷尾取血10 μ 1，與90 μ IPBS混 合，3000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，去上清檢測(cè)抗體。最后一次免疫后4周處死小鼠，去脾臟細(xì)胞 進(jìn)行原代培養(yǎng)，并通過(guò)ELISP0T檢測(cè)疫苗激活細(xì)胞免疫的情況。第一次免疫后，注射PCDNA3. l-S-C-181a組與pcDNA3. I-S組小鼠血清中抗-HBs 抗體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率分別為6/10與2/10，而注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. I-C組小鼠 血清中抗-HBc抗體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率分別為9/10與7/10。第二次免疫后，注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. I-S組小鼠血清中抗-HBs 抗體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率分別為9/10與5/10，而注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. I-C組小鼠 血清中抗-HBc抗體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率分別為10/10與8/10。第三次免疫后，注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. I-S組小鼠血清中抗-HBs 抗體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率分別為10/10與8/10，而注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. 1-C組小鼠 血清中抗-HBc抗體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率分別為10/10與9/10。待最后一次免疫后4周，頸椎脫白法處死小鼠，在無(wú)菌條件下取出脾臟，置于盛 有RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中，用玻棒研磨破碎，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液，IOOOr/ min離心lOmin。棄上清，用Hanks洗2遍，離心，將細(xì)胞重懸于含10% FBS的RPMI1640培 養(yǎng)基中。臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)每組小鼠活的的活淋巴細(xì)胞數(shù)目，調(diào)整細(xì)胞密度為3X105/ml，至 370C 5% CO2培養(yǎng)箱中以供ELISP0T檢測(cè)。ELISP0T檢測(cè)封閉ELISP0T培養(yǎng)板，按3X IO5/孔加入細(xì)胞，37°C 5% CO2培養(yǎng)箱 中孵育12h。依次加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體和酶標(biāo)記的抗體(GABA)，加入顯色劑顯色后， 觀察斑點(diǎn)形成。去除顯色液，使用去離子水清洗ELISP0T板。室溫干燥ELISP0T板，在倒置 顯微鏡下觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在HBsAg與HBV核心蛋白HBc刺激后，各實(shí)驗(yàn)組活性細(xì)胞數(shù)目顯著 高于刺激前水平。pcDNA3. l-S-C-181a組刺激后特異性細(xì)胞因子INF-γ和IL-4的分泌細(xì) 胞數(shù)量顯著高于其他兩組。圖5a為產(chǎn)生INF-Y的T細(xì)胞數(shù)目/IO6脾細(xì)胞。圖5b為產(chǎn)生 IL-4的T細(xì)胞數(shù)目/IO6脾細(xì)胞。* :p < 0. 05由此可以看出，本發(fā)明設(shè)計(jì)、構(gòu)建的核酸疫苗pcDNA3. 1-S-C_181a在激活機(jī)體體 液免疫、細(xì)胞免疫，產(chǎn)生抗HBs與HBc抗體血清與特異性的細(xì)胞因子等方面明顯的強(qiáng)與單純 HBV胞膜蛋白與核心蛋白的核酸疫苗。
權(quán)利要求
一種乙型肝炎核酸疫苗，以真核表達(dá)載體為基本骨架，其特征在于該疫苗含有乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因；還含有人的pre miR181a序列，其中乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；人的pre miR181a序列如SEQ ID NO4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎核酸疫苗，其特征在于其中所述的真核表達(dá)載 體為 pcDNA 3. 1/V5-His B 質(zhì)粒。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的乙肝核酸疫苗的構(gòu)建方法，包含以下步驟A、乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因以及人miR181a 前體基因克隆(I)以HBV全基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到HBVSDNA片段，引物序 列如下S-F :ATGGAGAGCACAACATCAGGS-F TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGA(II)以HBV全基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到HBVC抗原與e抗原的 DNA序列，引物序列如下C-F :ATGGACATTGACCCGTATAAC-F CTAACATTGAGATTCCCGAGAT(III)以THP-I細(xì)胞基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到miRlSla前體181F TCGACTTGAAACCCAGAGAGG18IR :AATTCACTGGACCACATTTGGB、將上述乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因以及人 miR181a前體基因插入同一真核表達(dá)載體pcDNA 3. l/V5_His B。
4.如權(quán)利要求1或2所述的乙肝核酸疫苗在用于制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，目前有報(bào)道的乙肝病毒疫苗主要包含HBsAg、preS1、preS2和HBcAg任意一種或者幾種基因，再加上一些具有免疫增強(qiáng)作用的細(xì)胞因子基因，或者淋巴細(xì)胞表位基因等，但是其免疫預(yù)防效果和治療效果一直不盡人意。本發(fā)明提供一種乙肝疫苗包括乙型肝炎病毒表面抗原基因HBsAg、核心蛋白基因HBc以及e抗原基因，還含有人microRNA181a前體基因序列，可以輔助刺激機(jī)體免疫通路。本疫苗的構(gòu)建過(guò)程涉及PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)操作手段。本疫苗能夠有效激活機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)乙型肝炎病毒的特異性抗體，并能夠刺激機(jī)體細(xì)胞免疫，分泌多種細(xì)胞因子，從而達(dá)到治療慢性乙型肝炎的目的。
文檔編號(hào)A61P31/20GK101954093SQ20101028066
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者商京麗, 孫樹(shù)漢, 章意亮, 魏偉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)