專利名稱：益母草水提物在制備治療缺血性心臟病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及中草藥益母草水提物在制備藥物組合物中的應(yīng)用， 尤其是在制備通過促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)治療缺血性心臟病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
缺血性心肌病，是近幾十年來在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家導(dǎo)致死亡的首要原因。 降低此類疾病的發(fā)病率和死亡率非常重要。心臟的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)禾口其它抗氧化齊LU 體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, R0S)產(chǎn)生增加，超過了內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，可加速人體的衰老、增加腫瘤的發(fā)生率，也可引起心血管系統(tǒng)的損傷，加重心肌破壞的程度。動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、中風(fēng)等疾病過程中，氧化應(yīng)激的機(jī)制也不容忽視。中草藥益母草(唇形科植物，Herba Leonuri，Chinese Motherwort)，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等古籍中，有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫的功效。中華人民共和國(guó)藥典(2000年版)中用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)閉、惡露不盡、水腫尿少、急性腎炎水腫等治療。未見有關(guān)治療缺血性心臟病的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供中藥益母草(Herba Leonuri，Chinese Motherwort，以下簡(jiǎn)稱HL)的活性成分在治療缺血性心臟病藥物中的新用途，尤其是在制備通過促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)治療缺血性心臟病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過大量的化學(xué)和藥理研究測(cè)得，中藥益母草含有豐富的生物堿類和羥基黃酮類成分，可作為藥物制劑的原料。本發(fā)明通過下述方法提取活性成分①取原藥材益母草，除去殘根、粗梗等雜質(zhì)，洗凈，粉碎后用80-100度的水煎煮。②水煎藥液經(jīng)濾過、濃縮后用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(High-performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)，使用光電二極管陣列探測(cè)器和電噴霧質(zhì)譜檢查，其中含有水蘇堿(Machydrine)、山萘素(Kaempferol)和槲皮素 (quercetin)等主要成分。本發(fā)明益母草的活性成分可作為藥物原料，直接或與藥學(xué)上通常用于制劑的固體或液體混合制成適宜制劑，包括膠囊、片劑、散劑以及復(fù)方制劑。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，益母草水提物具有較高的血管新生活性， 能促進(jìn)新生血管尤其是冠狀毛細(xì)血管的生長(zhǎng)，滿足缺血性心肌的氧供需求。


圖1是益母草水提物HPLC色譜圖，其中，益母草水提物50mg/ml，進(jìn)樣體積10 μ 1，碎片電壓100V.標(biāo)記峰*為水蘇堿和山萘素，**為槲皮素。圖2是體內(nèi)試驗(yàn)中HL的抑制細(xì)胞凋亡作用和促進(jìn)毛細(xì)血管新生的作用，其中，p53(A) ,Fas(B)，Bcl-xl (C)，Bcl-xs (D)禾Π VEGF (E)的 mRNA 水平的半定量分析，以GAPDH的基因表達(dá)為內(nèi)參，* 與給水心梗治療組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0. 05. # 與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0. 05 ；第一列HL心梗治療組；第二列給水心梗治療組；第三列假手術(shù)組。圖3是體外試驗(yàn)中HL的抑制細(xì)胞凋亡作用和促進(jìn)毛細(xì)血管新生的作用，其中，P53(A)，F(xiàn)as (B)，Bcl-xl (C)，Bcl-xs (D)和 VEGF (E)的 mRNA 水平的半定量分析，以GAPDH的基因表達(dá)為內(nèi)參，每組包括6孔細(xì)胞(標(biāo)準(zhǔn)六孔板)并且每組試驗(yàn)重復(fù)兩次， 標(biāo)準(zhǔn)差已標(biāo)識(shí)，* 與給水心梗治療組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0. 05 ；第一列給水低氧治療組；第二列HL低氧治療組；第三列給水非低氧對(duì)照組； 第四列HL非低氧對(duì)照組。圖4是體外臺(tái)盼蘭染色不相容試驗(yàn)細(xì)胞活力測(cè)定的比較，其中，每組包括六孔細(xì)胞(標(biāo)準(zhǔn)六孔板)每組試驗(yàn)重復(fù)兩次，標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)識(shí)如圖；* 與給水心梗治療組相比，P < 0. 05。
具體實(shí)施例方式以下例舉實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，實(shí)施例所示成分、比率、操作條件和順序等可在不脫離本發(fā)明精神的限定內(nèi)適當(dāng)變更。實(shí)施例1益母草水煎藥液經(jīng)濾過、濃縮后用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，使用光電二極管陣列探測(cè)器(DAD)和電噴霧(ESI)質(zhì)譜檢查，其中含有水蘇堿(Machydrine)、山萘素 (Kaempferol)和槲皮素(quercetin)等主要成分。實(shí)施例2取益母草水提物，添加適量微晶纖維素、淀粉或其他賦形劑，按常規(guī)方法分別制成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、丸劑等內(nèi)服劑型。實(shí)施例3HL的抑制細(xì)胞凋亡作用和促進(jìn)毛細(xì)血管新生的作用體內(nèi)試驗(yàn)體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)凋亡基因和VEGF基因的表達(dá)常規(guī)方法進(jìn)行p53(A)，F(xiàn)as(B)， Bcl-xl (C), Bcl-xs (D)和VEGF(E)的mRNA水平的半定量分析，以GAPDH的基因表達(dá)為內(nèi)參，結(jié)果顯示HL心梗治療組的凋亡基因Pra和Fas的表達(dá)明顯低于給水心梗治療對(duì)照組，P < 0. 05。相反，該組的凋亡抑制基因Bcl-xl的表達(dá)卻明顯高于對(duì)照組。Bcl-xs的基因表達(dá)水平則在兩組間沒有明顯的差異性。四例被檢測(cè)樣本中有三例證實(shí)HL對(duì)凋亡有抑制作用，表明HL在體內(nèi)對(duì)全身各系統(tǒng)有潛在抑制凋亡的作用。VEGF的基因在AMI組雖有表達(dá)， 但在假手術(shù)組并未檢測(cè)到該基因的表達(dá)(圖1)。結(jié)果表明組織損傷或低氧等狀態(tài)可以誘導(dǎo)VEGF基因表達(dá)的突然增加，引發(fā)血管新生以滿足氧供需求得增加。HL心梗治療組的VEGF 的基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P < 0. 05)，說明前者有較高的血管新生活性。
進(jìn)一步進(jìn)行冠狀毛細(xì)血管的計(jì)數(shù)，使用工具藥治療的心梗對(duì)照組的左心室毛細(xì)血管數(shù)221. 2士22. 5)明顯低于HL心梗治療組(316. 8士 16. 5) (ρ < 0. 05)。三組的心肌組織切片在梗死區(qū)均有壞死現(xiàn)象存在。 對(duì)照組的血管數(shù)量普遍較少。HL治療組左心室非心梗區(qū)的血管數(shù)也比較少。實(shí)施例4HL抑制細(xì)胞凋亡作用和促進(jìn)毛細(xì)血管新生作用的體外試驗(yàn)，體外試驗(yàn)檢測(cè)凋亡基因和VEGF表達(dá)水平的變化與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果相似，HL低氧治療組的P53，F(xiàn)as, Bcl-xs的mRNA低于對(duì)照組，P < 0. 05 (圖2)。同時(shí)，Bcl-xl基因表達(dá)水平在HL低氧治療組和對(duì)照組之間沒有明顯的差異。低氧介導(dǎo)的VSMC凋亡現(xiàn)象不依賴的 Bcl-xl基因的表達(dá)。此外，HL非缺氧治療組(HLC)和對(duì)照組(WC)之間的上述四個(gè)基因的表達(dá)沒有明顯差異，說明HL提取物對(duì)于生理狀態(tài)下的VSMC沒有細(xì)胞凋亡和血管新生作用， 說明了 HL有較少的負(fù)作用。本試驗(yàn)與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致，HL缺氧治療組的VEGF基因表達(dá)水平明顯高于低氧對(duì)照組P < 0. 05，但兩個(gè)非缺氧不同處理組之間該基因的表達(dá)沒有明顯差異性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HL可能在缺氧的條件下通過進(jìn)一步上調(diào)VEGF基因表達(dá)促進(jìn)毛細(xì)血管的新生，但在非缺氧的條件下正常劑量的HL并不發(fā)揮該作用。在上述體外試驗(yàn)中，細(xì)胞的基因相對(duì)表達(dá)水平?jīng)]有根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行校正。在利用Material等人描述的胰蛋白酶-EDTA的方法檢測(cè)細(xì)胞活力之后，這類細(xì)胞就不能再次用來提取RNA和進(jìn)行后續(xù)的RNA水平的分析。為了避免由于細(xì)胞數(shù)量的不同帶來的誤差， 本試驗(yàn)沒有利用細(xì)胞計(jì)數(shù)修正RNA水平，只是將細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果作為解釋RNA水平變化的一個(gè)參考值。實(shí)施例4體外細(xì)胞活力的測(cè)定采用臺(tái)盼蘭不相容試驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，HL低氧治療組的細(xì)胞活力稍高于對(duì)照組，P < 0. 05(圖3)。低氧組的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活力均明顯低于非缺氧組，P < 0. 05，HL低氧治療組和對(duì)照組之間細(xì)胞活力沒有明顯差異，提示HL在該劑量下對(duì)細(xì)胞沒有損害作用。盡管這種差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但HL低氧治療組的全部細(xì)胞數(shù)量高于低氧對(duì)照組。
權(quán)利要求
1.益母草水提物在制備治療缺血性心臟病藥物中的應(yīng)用，所述的益母草水提物通過下述方法制備①取原藥材益母草，除去殘根、粗梗等雜質(zhì)，洗凈，粉碎后用80-100度的水煎煮；②水煎藥液經(jīng)濾過、濃縮后用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，使用光電二極管陣列探測(cè)器和電噴霧質(zhì)譜檢查，其中含有水蘇堿、山萘素和槲皮素主要成分。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的應(yīng)用是所述的益母草水提物促進(jìn)冠狀毛細(xì)血管生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及中草藥益母草水提物在制備藥物組合物中的應(yīng)用，尤其是在制備通過促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)治療缺血性心臟病藥物中的應(yīng)用。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，益母草水提物具有較高的血管新生活性，能促進(jìn)新生血管尤其是冠狀毛細(xì)血管的生長(zhǎng)，滿足缺血性心肌的氧供需求。本發(fā)明益母草的活性成分可作為藥物原料，直接或與藥學(xué)上通常用于制劑的固體或液體混合制成適宜制劑，包括膠囊、片劑、散劑以及復(fù)方制劑。
文檔編號(hào)A61K36/533GK102512493SQ20111041942
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2006年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日
發(fā)明者朱依純, 朱依諄 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)